尚曉琳，于曉彩，季秋憶，張健，吳云英，楊利

（大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023）

用辣根過(guò)氧化物酶催化降解海水中柴油污染的研究

尚曉琳，于曉彩，季秋憶，張健，吳云英，楊利

（大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023）

為深入探索酶催化技術(shù)在海洋石油污染處理中的應(yīng)用，以游離辣根過(guò)氧化物酶 （HRP）催化降解海水中柴油污染，研究了酶用量、溶液pH值、柴油初始濃度和催化反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響，確定了HRP催化降解海水中柴油污染的優(yōu)化工藝條件，同時(shí)考察了反應(yīng)助劑對(duì)海水中柴油污染去除率的影響。結(jié)果表明：HRP能有效催化降解海水的柴油污染，當(dāng)海水中柴油的質(zhì)量濃度為1.2 g/L時(shí)，在溫度為25℃、HRP加入量為1.6 U/mL、H2O2為250 mg/L、溶液pH為5的條件下，催化降解3 h，柴油去除率可達(dá)90.77%；聚乙二醇 （PEG）對(duì)HRP催化降解海水中的柴油污染有較顯著的影響。

游離辣根過(guò)氧化物酶；海洋油污染；聚乙二醇；酶催化氧化

近年來(lái)，海洋溢油事故的頻繁發(fā)生以及近海工業(yè)、運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，導(dǎo)致大量含油污水流入海洋，石油類(lèi)化合物已成為海洋污染主要的污染物之一［1］。在處理海洋石油污染特別是海洋溢油事故時(shí)，采用物理方法收集溢油后，海水中殘留的石油足以破壞生態(tài)環(huán)境，而采用化學(xué)方法處理常會(huì)導(dǎo)致二次污染［2］，因此，尋求高效、快速修復(fù)海洋石油污染顯得更加迫切。用酶處理石油污染具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)［3］。自20世紀(jì)80年代初起，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，酚氧化酶和木質(zhì)素分解酶，如辣根過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶，是一類(lèi)特異性比較低的酶，它能同時(shí)進(jìn)行催化氧化反應(yīng)和化學(xué)聚合，克服了酶的單一性，為酶催化技術(shù)在海洋石油污染處理中的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新途徑［4-6］。本研究中，以游離辣根過(guò)氧化物酶催化降解模擬柴油污染海水，研究了酶催化降解柴油污染中的酶用量、pH值、柴油濃度和催化反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)催化降解柴油的影響，旨在尋求一種高效、經(jīng)濟(jì)、清潔的海洋柴油污染處理方法。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)試劑主要有游離辣根過(guò)氧化物酶 （HRP）（活力250 U/mg以上）、聚乙二醇 （PEG）、4-氨基安替比林、30%過(guò)氧化氫。試驗(yàn)儀器主要有低速離心機(jī)、pH計(jì)、752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2方法

取100 mL模擬油污染海水置于250 mL錐形瓶中，用磷酸鹽緩沖液預(yù)先調(diào)節(jié)含油水樣的pH至一定值，加入試驗(yàn)量的HRP溶液和H2O2溶液，塞住瓶口，置于可調(diào)溫的搖床中進(jìn)行恒溫反應(yīng)。從H2O2加入開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)完畢后分別加入160 mg/L的Al2（SO4）3，以3000 r/min離心15 min，用分光光度法測(cè)定上清液中殘存柴油的含量。測(cè)定反應(yīng)助劑影響時(shí)在加入H2O2前先加入PEG。

2 結(jié)果與討論

2.1溫度對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響

在海水的油污染濃度為1.2 g/L、HRP為1.6 U/mL、H2O2為350 mg/L、pH為7.5條件下，改變反應(yīng)溫度 （15～30℃），考察其對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，去除率逐漸增大，當(dāng)溫度為25℃時(shí)效果最好，繼續(xù)升高溫度，去除率下降。原因可能是生物酶在一定溫度下保持了較高的活性，并且不同的酶有不同的溫度界限，當(dāng)溫度超過(guò)酶的溫度界限后，酶催化反應(yīng)速率就會(huì)明顯降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，HRP在15～25℃范圍內(nèi)有較好的催化氧化活性，30℃是達(dá)到催化氧化的溫度界限，溫度再升高，HRP對(duì)柴油的去除率明顯下降。因此，本試驗(yàn)條件下最佳反應(yīng)溫度為25℃。

圖1　反應(yīng)溫度對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on enzymatic oxidation of marine diesel pollution

2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化降解海水柴油污染的影響

在海水的油污染濃度為1.2 g/L、HRP為1.6 U/mL、H2O2為350 mg/L、pH為7.5、反應(yīng)溫度為25℃條件下，改變反應(yīng)時(shí)間 （0.5～5.0 h），考察其對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，反應(yīng)進(jìn)行的前3 h，柴油去除率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，3 h后去除率僅略微增大。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)一定時(shí)間后，由于反應(yīng)體系中底物 （油、過(guò)氧化氫）的減少，反應(yīng)逐漸趨于平緩，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，反應(yīng)速率增長(zhǎng)就很慢。因此，本試驗(yàn)條件下反應(yīng)時(shí)間控制在3 h較合適。

圖2　反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響Fig.2 Effect of reaction time on enzymatic oxidation of marine diesel pollution

2.3HRP濃度對(duì)酶催化降解海水柴油污染的影響

在海水的油污染濃度為1.2 g/L、H2O2為350 mg/mL、pH為 7.5、溫度為25℃條件下，改變HRP濃度 （0.4～2.4 U/mL），在恒溫水浴鍋內(nèi)震蕩3 h，用分光光度法測(cè)定反應(yīng)后柴油的去除率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著HRP濃度的增加，柴油去除率逐漸增大，當(dāng)酶濃度為 1.6 U/mL時(shí)，柴油去除率達(dá)到最大值，此后，隨著HRP濃度的增加，柴油去除率反而降低，說(shuō)明過(guò)量的HRP不利于柴油的去除。原因可能是在最佳HRP用量的條件下，HRP與水樣中的有機(jī)物反應(yīng)最為充分，兩者之間達(dá)到了最佳反應(yīng)平衡，但隨著HRP濃度的增加，可能將酶包覆在所形成的聚合物中，影響了HRP活性的發(fā)揮，使酶的催化氧化反應(yīng)效率降低，從而影響了柴油去除率。喬彤森等［7］也有相似的試驗(yàn)結(jié)果。因此，本試驗(yàn)條件下最佳HRP濃度范圍為1.2～2.0 U/mL。

圖3　酶濃度對(duì)催化降解海水中柴油污染的影響Fig.3 Effect of horseradish peroxidase（HRP）concentration on enzymatic oxidation of marine diesel pollution

2.4pH對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響

在海水的油污染濃度為1.2 g/L、HRP為1.6 U/mL、H2O2為350 mg/L、溫度為25℃條件下，改變?nèi)芤旱膒H值 （5.0～9.0），考察pH對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，pH從5.0增至7.5時(shí)，隨著pH的增大，柴油去除率逐漸增大，當(dāng)pH為7.5時(shí)，柴油去除率達(dá)到最大值，為73.23%，此后隨著pH的增大，柴油去除率逐漸降低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是：①由蛋白質(zhì)組成的酶對(duì)pH的變化非常敏感；②過(guò)酸或過(guò)堿的催化環(huán)境使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成酶活性喪失；③過(guò)酸或過(guò)堿的反應(yīng)條件可能使底物不能完全分解成產(chǎn)物或影響了底物的解離。圖4也與多數(shù)情況下，酶催化反應(yīng)速度隨pH的變化呈左右對(duì)稱(chēng)的 “鐘罩”型圖相符合［8］。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH為6.0～8.0時(shí)，HRP催化反應(yīng)都有較大的酶催化降解率。因此，本試驗(yàn)條件下最佳pH為7.5。

2.5H2O2濃度對(duì)酶催化降解柴油污染的影響

在海水的油污染濃度為1.2 g/L、HRP為1.6 U/mL、溫度為25℃、pH為 7.5條件下，改變H2O2的濃度 （50～750 mg/L），考察其對(duì)酶催化降解海水中柴油去除率的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著H2O2濃度的增加，柴油去除率逐漸增大，當(dāng)H2O2濃度為350 mg/L時(shí)，去除率達(dá)最大值，繼續(xù)增大H2O2濃度，柴油去除率逐漸減小。原因可能是高濃度H2O2溶液變成酶催化反應(yīng)的抑制劑，使酶內(nèi)部肽鏈斷裂，破壞酶的空間構(gòu)象，使其失去催化功能；而H2O2的量不足，則不能達(dá)到最佳降解效果［9］。

圖4　pH對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響Fig.4 Effect of pH value on enzymatic oxidation of marine diesel pollution

圖5　H2O2濃度對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響Fig.5 Effect of H2O2concentration on enzymatic oxidation of marine diesel pollution

2.6PEG對(duì)HRP催化氧化反應(yīng)的影響

近來(lái)一些研究表明，殼聚糖、PEG等大分子可用來(lái)修飾酶表面的氨基酸［10］。本試驗(yàn)中選取PEG（酶活力為500～20 000 U）這種既溶于水又溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑的兩性分子，PEG的修飾可以保護(hù)穩(wěn)定酶分子構(gòu)向的次級(jí)鏈，從而使酶具有抵抗熱、酸、堿對(duì)其破壞的能力。本試驗(yàn)中，在海水的油污染濃度為1.2 g/L、HRP為1.6 U/mL、pH 為7.5、H2O2濃度為350 mg/L、溫度為25℃條件下，在反應(yīng)體系中添加不同濃度的PEG（0～160 mg/L）作為反應(yīng)助劑，考察其對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，反應(yīng)體系中加入PEG后，隨著其濃度的增加，柴油去除率逐漸增大，當(dāng)PEG濃度為160 mg/L時(shí)，去除率最大，可見(jiàn)，PEG在酶催化降解柴油污染反應(yīng)中有一定的促進(jìn)作用，影響效果較明顯。

圖6　反應(yīng)助劑對(duì)酶催化降解海水中柴油污染的影響Fig.6 Effeet of reaction additive concentration on enzymatic oxidation of marine diesel pollution

2.7酶催化降解海水中柴油污染的優(yōu)化試驗(yàn)條件

選擇HRP濃度、pH、酶催化反應(yīng)時(shí)間、酶催化反應(yīng)溫度、雙氧水濃度5個(gè)因素進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。極差分析結(jié)果表明，影響酶催化降解海水中柴油污染的各因素的主次關(guān)系依次為：溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞HRP濃度＞溶液pH＞H2O2濃度，理論最優(yōu)組合為 A1B3C3D4E2，即 pH 為5、反應(yīng)時(shí)間為3 h、溫度為25℃、HRP濃度為2.0 U/mL、H2O2濃度為150 mg/L條件下，柴油去除效率最好。但從表1可見(jiàn)，正交試驗(yàn)的第3號(hào)試驗(yàn)組合 （A1B3C3D3E3）的柴油去除率最高，達(dá)到90.77%，該組合為試驗(yàn)中效果最好的組合?？紤]到實(shí)際操作中的成本問(wèn)題、單因素試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合HRP濃度在最佳濃度1.6 U/mL 和H2O2在最佳濃度350 mg/L左右時(shí)對(duì)催化反應(yīng)的影響均較顯著，以及正交試驗(yàn)中第3號(hào)試驗(yàn)組合的高去除率，因此，本試驗(yàn)中確定正交試驗(yàn)中的第3號(hào)試驗(yàn)組合為最優(yōu)試驗(yàn)組合，即酶催化降解海水中柴油污染的優(yōu)化試驗(yàn)條件為：pH為5，HRP濃度為1.6 U/mL，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間3 h，H2O2濃度為250 mg/L。

3 結(jié)論

（1）游離辣根過(guò)氧化物酶能有效催化降解海水中的柴油污染，其中酶用量、溶液pH、溫度和催化反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)酶催化降解海水中柴油污染有較顯著影響，影響酶催化降解海水中柴油污染的各因素的主次關(guān)系依次為反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞催化劑HRP濃度＞溶液pH＞H2O2濃度。

（2）酶催化降解海水的柴油污染的優(yōu)化試驗(yàn)條件：海水的油污染濃度為1.2 g/L、HRP酶濃度為1.6 U/mL、H2O2濃度為250 mg/L、pH為5、催化反應(yīng)溫度為25℃、反應(yīng)時(shí)間為3 h。在此條件下，柴油去除率可達(dá)90.77%。

（3）PEG在酶催化氧化柴油的反應(yīng)中有一定的促進(jìn)作用，添加PEG能有效提高游離辣根過(guò)氧化物酶HRP催化降解海水中柴油污染的去除率，且隨PEG濃度的增加，去除率不斷升高。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Designed matrix and results for orthogonal experiment

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Catalytic oxidation degradation of marine diesel pollution by horseradish peroxidase

SHANG Xiao-lin，YU Xiao-cai，JI Qiu-yi，ZHANG Jian，WU Yun-ying，YANG Li
（College of Marine Science and Environment，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The influence of dosage，solution pH value，diesel initial concentration and catalytic period on free horseradish peroxidase（HRP）degradation of marine diesel pollution were studied and optimized for the process conditions by orthogonal experiment to exploite utilization of horseradish peroxidase in the catalytic oxidation degradation of marine diesel pollution.The removal of marine diesel pollution by a reaction promoter was observed.The results showed that free horseradish peroxidase was shown to degradate the diesel pollution in the seawater effectively under the optimum conditions of diesel initial concentration of 1.2 g/L，temperature of 25℃，HRP activity concentration of 1.6 U/mL，H2O2mass concentration of 250 mg/L，pH 7.5 and reaction time of 3 h，with the diesel removal rate of 90.77%.It was found that polyethylene glycol（PEG）improved the efficiency for HRP catalytic oxidation in seawater diesel pollution.

horseradish peroxidase（HRP）；marine oil pollution；polyethylene glycol（PEG）；enzymatic oxidation

X703.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.019

2095-1388（2016）01-0113-04

2015-04-26

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng) （201305002）；遼寧省海洋漁業(yè)廳科研項(xiàng)目 （2011024）；國(guó)家海洋局海洋溢油鑒別與損害評(píng)估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題 （201205）

尚曉琳 （1991—），女，碩士研究生。E-mail：1185988952@qq.com

于曉彩 （1964—），女，博士，教授。E-mail：xiaocyu@dlou.edu.cn