陳　聃，凌　文，陳　賽（長沙市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南長沙410015）

·論著·

c-FLIP 在不同宮頸組織中的表達(dá)及臨床意義

陳聃，凌文，陳賽（長沙市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南長沙410015）

目的研究c-FLIP在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）、正常宮頸的表達(dá)情況。方法選取2010～2014年該院病理科存檔且臨床資料完整的婦產(chǎn)科門診及住院患者的宮頸組織蠟塊共118例，其中正常宮頸18例，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)（CINⅠ級(jí)）17例，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)（CINⅡ～Ⅲ級(jí)）16例，宮頸癌67例，采用免疫組化SP方法檢測(cè)c-FLIP在正常宮頸、CIN、宮頸癌中的表達(dá)，并對(duì)宮頸癌的FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和病理類型等進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果c-Flip在正常宮頸、CINⅠ級(jí)、CINⅡ～Ⅲ級(jí)以及宮頸癌組中的陽性表達(dá)率分別為11.1%、23.5%、62.5%、85.1%，CINⅡ～Ⅲ級(jí)組、宮頸癌組與正常宮頸組、CINⅠ級(jí)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而宮頸癌組與CINⅡ～Ⅲ級(jí)組、CINⅠ級(jí)組與正常宮頸組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。c-FLIP蛋白在宮頸癌低分化組陽性表達(dá)率均高于高、中分化組（P＜0.05），而與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論c-FLIP與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)宮頸癌病變程度的評(píng)估有一定參考價(jià)值，可能成為治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)。

c-FLIP；宮頸腫瘤；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；子宮頸；免疫組織化學(xué)

宮頸癌是目前全世界最為常見的婦科惡性腫瘤之一，在全世界女性中的發(fā)病率僅次于乳腺癌，也是發(fā)展中國家女性最主要的死亡原因之一。近年來，宮頸癌的發(fā)病率明顯增加，而且其發(fā)病率還有年輕化的趨勢(shì)。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜而且漫長的過程，并且由多種基因參與，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)無論是腫瘤增殖還是凋亡，都與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控有關(guān)。近幾年新發(fā)現(xiàn)，c-FLIP蛋白也屬于一類天然存在的凋亡抑制蛋白，具有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)［1］。有研究表明，在多種人類腫瘤組織中c-FLIP蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，且與許多人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［2］，

本研究旨在初步探討c-FLIP蛋白在宮頸不同組織中表達(dá)的臨床意義，具體報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2010～2014年本科手術(shù)或者活檢患者，經(jīng)本院病理科閱片證實(shí)的宮頸組織蠟塊共118例，其中正常宮頸18例，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)（CINⅠ級(jí)）17例，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)（CINⅡ～Ⅲ級(jí)）16例，宮頸癌67例，67例宮頸癌患者年齡25～73歲，平均（47.22± 9.71）歲，其中鱗癌50例，腺癌17例；根據(jù)分化程度分，高中分化16例，低分化51例；＞40歲49例，≤40歲18例；FIGO臨床分期，Ⅰ期27例，Ⅱa～Ⅱb期40例；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性49例，陽性18例；16例CINⅡ～Ⅲ級(jí)患者年齡27～57歲，平均（41.44±8.33）歲。17例CINⅠ級(jí)患者，年齡23～47歲，平均（34.88±7.38）歲。18例正常宮頸患者，年齡29～51歲，平均（38.94± 6.47）歲。所選病例臨床資料完整。

1.2方法

1.2.1免疫組化兔抗人c-FLIP多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔Streptavidin-HRP試劑盒購買于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，內(nèi)源性過氧化物酶封閉，微波抗原修復(fù)，血清封閉，兔抗人c-FLIP多克隆抗體1∶150 4℃孵育過夜，再以生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 37℃孵育15 min，HRP標(biāo)記鏈霉素親和素37℃孵育10 min，最后用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇逆度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每一步驟間均用pH7.4 PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。

1.2.2判斷標(biāo)準(zhǔn)用PBS代替一抗作為空白對(duì)照，用生物公司提供的陽性切片作為陽性對(duì)照。參照Axiotis等［3］的標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞所占比例和高倍鏡（×400）下綜合染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量測(cè)定。c-FLIP的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒，陰性者無此變化。鏡下取5個(gè)（400×）高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)左右細(xì)胞，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例并評(píng)分：4分：＞75%；3分：＞50%～75%；2分：＞25%～50%；1分：＞5%～25%；0分：0%～5%。（2）根據(jù)著色細(xì)胞的著色強(qiáng)弱評(píng)分：3分：棕褐色；2分：棕黃色；1分：淡黃色；0分：無著色。（3）以上2項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相加后判斷：5～7分：+++；3～4分：++；1～2分：+；0分：-。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)（-）為陰性表達(dá)，（+）、（++）、（+++）均為陽性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1c-FLIP蛋白在CIN、宮頸癌中及正常宮頸中的表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)里面，主要是c-FLIP蛋白的陽性表達(dá)區(qū)，陽性細(xì)胞往往呈淡黃色至棕褐色顆粒，正常宮頸中未見明顯c-FLIP染色陽性細(xì)胞（圖1），CIN中c-FLIP染色陽性細(xì)胞呈彌散分布（圖2），而宮頸癌中c-FLIP染色陽性細(xì)胞成團(tuán)分布（圖3）。

圖1　正常宮頸中c-FLIP呈陰性表達(dá)（左圖：×100；右圖：×400）

圖2　CINⅢ中c-FLIP呈陽性表達(dá)（左圖：×100；右圖：×400）。

圖3　宮頸癌中c-FLIP呈陽性表達(dá)（左圖：×100；右圖：×400）。

c-FLIP蛋白在正常宮頸、CINⅠ級(jí)、CINⅡ～Ⅲ級(jí)以及宮頸癌組中的陽性表達(dá)率分別為 11.1%（2/18）、23.5%（4/17）、62.5%（10/16）、85.1%（57/67），呈逐漸遞增的趨勢(shì)，見表1。除宮頸癌組與CINⅡ～Ⅲ級(jí)組、CINⅠ級(jí)組與正常宮頸組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　c-FLIP蛋白在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的表達(dá)情況

2.2c-FLIP蛋白的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系FIGOⅠ期宮頸癌患者c-FLIP蛋白陽性表達(dá)率為77.8%（21/27），Ⅱa～Ⅱb期宮頸癌患者c-FLIP蛋白陽性表達(dá)率為90.0%（36/40），兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.304）；c-FLIP蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的陽性表達(dá)率為94.4%（17/18），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的陽性表達(dá)率為81.6%（40/49），兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.359）；c-FLIP蛋白在低分化組的陽性表達(dá)率為92.2%（47/51），在高分化組的陽性表達(dá)率為62.5%（10/16），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）；c-FLIP蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組中的陽性表達(dá)率為84.0%（42/50），在宮頸腺癌組中的陽性表達(dá)率為88.2%（15/17），兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.977）。見表2。

表2　c-FLIP蛋白的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

3　討　論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多個(gè)功能不同的基因異常激活或者失活，即細(xì)胞的癌變是由多基因、多階段互相配合、共同作用的結(jié)果。不僅僅是細(xì)胞增殖失控、分化異常的結(jié)果，更重要的是與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失控（凋亡程序被抑制，細(xì)胞周期調(diào)控被破壞）有密切的關(guān)系。細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種自主性細(xì)胞有序死亡的過程，并在復(fù)雜和嚴(yán)格的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下完成，而這些因素又是體外誘因，細(xì)胞凋亡受到死亡配體、化療藥、DNA損傷、紫外線、細(xì)胞因子等多種因素的影響，正常情況下，體內(nèi)細(xì)胞凋亡平衡，維持著自身細(xì)胞增殖和死亡之間的動(dòng)態(tài)平衡。與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路有線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡通路和配體結(jié)合誘導(dǎo)的外源性凋亡通路。細(xì)胞通過影響內(nèi)源性或者外源性的機(jī)制來逃避凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，為了更進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)生，提高臨床腫瘤的診治率，加強(qiáng)細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子研究無疑是一種有效的途徑。

FLIP是由Thome等［4］于1997年發(fā)現(xiàn)，病由所在研究的病毒中首次分離出來，并發(fā)現(xiàn)有皰疹病毒編碼，稱之為vFLIP（viral FLIP）。同年，Irmler等［5］推測(cè)FLIP也可能存在細(xì)胞中，隨后在研究惡性黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)亦存在可以抑制細(xì)胞凋亡的高表達(dá)的FLIP，首先將其命名為c-FLIP（cellular FLIP，c-FLIP）。c-FLIP被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白，其過量表達(dá)能抑制Fas，TRAIL-R，DR3，TNFR-1等介導(dǎo)的凋亡途徑，使異常的腫瘤細(xì)胞凋亡減少，從而使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加，最終發(fā)展為癌變。c-FLIP在病毒、真核生物、哺乳動(dòng)物等許多物種中廣泛存在，定位于人染色體2號(hào)染色體長臂3區(qū)3-4帶（2q33-34），目前已經(jīng)鑒定出13個(gè)基因型，但僅有3個(gè)可轉(zhuǎn)錄出蛋白：長片段c-FLIPL、短片段c-FLIPS及來自淋巴瘤細(xì)胞c-FLIPR，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為55×103、26×103、24×103。三者在N端均存在2個(gè)串聯(lián)的與Fas的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）的功能相似的含40個(gè)氨基酸死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED），但是在C端則差異很大。c-FLIPL與c-FLIPS、c-FLIPR比較，C端多了Caspase蛋白水解酶區(qū)域，即一個(gè)與Caspase8相似的Caspase同源結(jié)構(gòu)域，但由于組氨酸和半胱氨酸在Caspase8中主要起催化的作用，而這2個(gè)氨基酸殘基在c-FLIP中卻被精氨酸和酪氨酸替代，因而c-FLIP便喪失了蛋白水解酶的活性，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Fas相關(guān)死亡區(qū)（Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）或Caspase8/10上的死亡效應(yīng)區(qū)（DED），阻斷死亡信號(hào)復(fù)合體（DISC）形成和Caspase8/10的活化，使Caspase8的級(jí)聯(lián)反應(yīng)不能繼續(xù)，從而抑制死亡受體Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［1］。目前Fas-FasL介導(dǎo)的信號(hào)通路是研究較為清楚的細(xì)胞凋亡途徑。Fas 與FasL識(shí)別后被活化，形成聚合體，使Fas的DD聚集，F(xiàn)as以DD為橋梁與FADD結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（death-inducing signaling complex，DISC），之后借其DED與Caspase8前體的DED結(jié)合，使Caspase8前體寡聚，并使其活化為Caspase-8，進(jìn)而活化下游Caspase效應(yīng)子（caspase-3，caspase-7），產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使細(xì)胞凋亡。

c-FLIP蛋白在許多腫瘤中高表達(dá)，而在其對(duì)應(yīng)的良性病變或正常組織中低表達(dá)或者不表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在惡性黑色素瘤中c-FLIP蛋白表達(dá)率明顯高于良性病變。亦有研究表明c-FLIP蛋白在其他腫瘤組織中高表達(dá)［6-7］，而其對(duì)應(yīng)的正常組織或者良性病變中不表達(dá)或者低表達(dá)。Wilkie-Grantham等［8］用42例子宮內(nèi)膜癌和22例正常子宮內(nèi)膜進(jìn)行免疫組化，發(fā)現(xiàn)c-FLIP蛋白在前者中明顯強(qiáng)表達(dá)。陳立立等［9］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，卵巢癌動(dòng)物血清中的c-FLIP蛋白表達(dá)明顯增多。本研究結(jié)果顯示c-FLIP蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞呈淡黃色至棕褐色顆粒，陽性著色主要位于細(xì)胞質(zhì)中。c-FLIP蛋白的表達(dá)水平隨著宮頸病變級(jí)別的升高而有明顯增高趨勢(shì)，且宮頸癌組、CINⅡ～Ⅲ級(jí)組與正常組、CINⅠ級(jí)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示檢測(cè)c-FLIP蛋白可能參與了宮頸癌的發(fā)病過程。

此外，本研究還探討了c-FLIP蛋白與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)c-FLIP蛋白的表達(dá)與FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型無關(guān)，僅與細(xì)胞分化程度相關(guān)，在低分化組高表達(dá)，在高分化組低表達(dá)。提示檢測(cè)c-FLIP蛋白可能有助于宮頸癌病變程度的評(píng)估。有研究報(bào)道，在乳腺癌中c-FLIP蛋白的表達(dá)與乳腺癌組織分級(jí)之間有顯著相關(guān)性，隨組織分級(jí)增高表達(dá)升高［10］，此與本研究結(jié)果相似。然而也有不少研究結(jié)果與本研究有差別，如c-FLIP蛋白的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的臨床分期及肌層浸潤深度呈顯著性相關(guān)，在臨床分期較晚和肌層浸潤較深組c-FLIP蛋白表達(dá)水平顯著增高［11］。其表達(dá)與胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。而cFLIP蛋白在不同腫瘤中的作用有所不同，可能是因?yàn)閏FLIP蛋白存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制，從而使其對(duì)不同腫瘤的生物學(xué)行為有不同的影響，這值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，c-FLIP可能參與了宮頸癌的發(fā)病過程。c-FLIP蛋白在低分化組中的表達(dá)高于高中分化組，提示c-FLIP對(duì)宮頸癌病變程度的評(píng)估有一定參考價(jià)值。

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Expression and clinical significance of c-FLIP in different cervical tissues

Chen Dan，Ling Wen，Chen Sai（Department of

Obstetrics and Gynecology，Changsha Municipal Third Hospital，Changsha，Hunan 410015，China）

ObjectiveTo detect the expression situationof c-FLIP in cervical carcinoma，CIN and normal cervix.MethodsA total of 118 paraffin embedded cervical tissue samples in the pathology department of our hospital for keeping in the achieves and with intact data during 2010-2014 were selected，including 18 cases of normal cervix，17 cases of cervical intraepithelialneoplasia gradeⅠ（CINI），16cases of CINgradeⅡ-Ⅲ（CINⅡ-Ⅲ）and 67 cases of cervicalcancer.The immunohistochemical SP method was used to detect the expression of c-FLIP protein in normal cervix，CIN and cervical carcinoma.Then the correlation analysis of the cervical cancer clinical FIGO classification，lymph node metastasis，differentiation degree and pathological type was performed.ResultsThe positive expression rates of c-FLIP in normal cervix，CINⅠ，CINⅡ-Ⅲand cervical cancer tissues were 11.1%，23.5%，62.5%and 85.1%respectively，the differences between the CINⅡ-Ⅲgroup and cervical cancer group with the normal cervix group and CINⅠgroup were statistically significant（P＜0.05），but the differences between the cervical cancer group and CINⅡ-Ⅲgroup and between the CIN I group and normal cervix group were not statistically significant（P＞0.05）.The positive expression rate of c-FLIP in the low differentiation group of cervical cancer was higher than that in the high and middle differentiation groups（P＜0.05），while which had no relation with the FIGO classification，lymph node metastasis and pathological type（P＞0.05）.Conclusionc-FLIP is closely related with the occurrence and progression of cervical cancer，has certain reference value for evaluating the cervical cancer lesion and may become a potential target point for treatming cervical cancer.

c-FLIP；Uterine cervical neoplasms；Cervical intraepithelial neoplasia；Cervix uteri；Immunohistochemistry

·論著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.009

A

1009-5519（2016）03-0346-03

陳聃（1981-），主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

（2015-10-12）