單瑩，高丹，劉勇，盧麗萍，秦曉松，鄭銳

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

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骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合細(xì)胞化學(xué)染色檢測在神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷中的應(yīng)用

單瑩，高丹，劉勇，盧麗萍，秦曉松，鄭銳

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

目的探討骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合細(xì)胞化學(xué)染色檢測在神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)診斷中的應(yīng)用。方法 NB患兒33例(病例組)，F(xiàn)3抗體陽性。對照組選自同期住院的患兒20例，F(xiàn)3抗體陰性。對兩組進(jìn)行常規(guī)的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微鏡鏡檢和細(xì)胞化學(xué)染色[過氧化物酶(POX)﹑堿性磷酸酶(NAP)﹑糖原(PAS)染色)]，并對其診斷效能進(jìn)行分析。結(jié)果兩組NAP、POX、PAS染色陽性率比較，P均<0.01。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)紫紅色的條索狀纖維樣物質(zhì)和瘤細(xì)胞呈菊花團(tuán)排列是診斷和鑒別診斷NB方法之一。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察聯(lián)合PAS染色診斷NB的靈敏度及特異度均高于單獨(dú)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及PAS染色(P均<0.01)。結(jié)論 在形態(tài)學(xué)中發(fā)現(xiàn)紫紅色的條索狀纖維樣物質(zhì)和瘤細(xì)胞呈菊花團(tuán)排列是診斷和鑒別診斷NB方法之一。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合細(xì)胞化學(xué)染色(PAS)可提高NB的診斷率。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞化學(xué)染色；診斷

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)是最常見的兒童惡性實(shí)體腫瘤之一，病死率高[1]，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[2]。NB在新生兒期即可發(fā)病，早期便發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，嚴(yán)重威脅兒童生命，其轉(zhuǎn)移部位為骨、淋巴結(jié)、骨髓、眼眶和皮膚等[4]，且與原發(fā)灶大小無關(guān)。發(fā)病隱匿，早期診斷比較困難。發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移時(shí)，轉(zhuǎn)移至骨髓內(nèi)的瘤細(xì)胞在形態(tài)上與原幼淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞很難區(qū)別，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)不同原發(fā)灶的骨髓轉(zhuǎn)移形態(tài)特點(diǎn)不同，共同特點(diǎn)是涂片及邊緣可見數(shù)量不等，散在的成團(tuán)、成簇的細(xì)胞[5]，多數(shù)病例的瘤細(xì)胞酷似原幼淋巴細(xì)胞，當(dāng)病灶很小時(shí)，往往造成誤診誤治。 本研究中，我們結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色做對比觀察，為NB篩查診斷提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色的診斷依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料取2008年8月～2012年6月于本院住院的NB患兒33例(病例組)，F(xiàn)3抗體陽性?；純耗?0例、女13例，平均年齡2.18歲。對照組選自同期住院的患兒20例，F(xiàn)3抗體陰性。患兒男7例、女13例，平均年齡3.69歲。20例中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤3例，腎母細(xì)胞瘤9例，脂肪瘤2例，橫紋肌肉瘤2例，骨肉瘤1例，畸胎瘤1例，肝母細(xì)胞瘤1例，腎癌1例。

1.2方法采用骨髓穿刺法獲取髂前或髂后骨髓細(xì)胞。兩組分別進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢及血細(xì)胞涂片，血細(xì)胞涂片用淋巴分層液分離細(xì)胞，用甩片機(jī)甩片(瘤細(xì)胞數(shù)>10%)，形態(tài)學(xué)染色為常規(guī)瑞氏染色法。①細(xì)胞形態(tài)學(xué)：按照骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的質(zhì)量控制[6]和具有豐富閱片經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員顯微鏡檢，每次染色都有陽性質(zhì)控涂片及陰性質(zhì)控涂片作對照，并在油鏡下觀察原始細(xì)胞，根據(jù)胞質(zhì)中顆粒數(shù)和顏色進(jìn)行劃分。②過氧化物酶(POX)染色：使用戊二醛-丙酮固定，水沖，加反應(yīng)液，室溫10 min，水洗后染色，再水洗，干燥后鏡檢。③堿性磷酸酶(NAP)染色：10%甲醛甲醇固定液30 s水洗，待干，涂片浸入基質(zhì)孵育液，水洗待干后，鏡檢。④糖原(PAS)染色：新鮮干燥的涂片乙醇固定10 min，水洗待干，過碘酸液20 min水洗待干，雪夫液30 min染色，用亞硫酸液沖洗，再用水沖洗待干，復(fù)染水洗，待干，鏡檢。⑤單克隆抗體與NB細(xì)胞反應(yīng)(APAAP)法。應(yīng)用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的單克隆F3(Ⅰ抗)，熒光標(biāo)記羊抗屬免疫球蛋白(Ⅱ抗)進(jìn)行免疫熒光染色[7]。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)：細(xì)胞形態(tài)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，換算成百分率，瘤細(xì)胞占陽性的百分比，典型成團(tuán)細(xì)胞和細(xì)胞呈菊花團(tuán)樣或砌墻樣排列或看見條索狀纖維絲樣物質(zhì)均按陽性計(jì)數(shù)。細(xì)胞化學(xué)染色：①POX染色：見胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)黑色顆粒為陽性。無顆粒為陰性，顆粒小，分布稀疏為弱陽性；②NAP染色[8]：顆粒略粗較密集為陽性，顆粒粗大且布滿于整個(gè)胞質(zhì)中為強(qiáng)陽性，無顆粒為陰性，稍有顆粒為弱陽性；③PAS染色(常規(guī)的過碘酸-雪夫反應(yīng)法)：在油鏡下觀察200個(gè)原始細(xì)胞，根據(jù)胞質(zhì)中顆粒數(shù)和顏色劃分，無顆粒為陰性，彌散性淺粉色為弱陽性，顆粒染色較深呈紫紅色為陽性，紅色粗大顆?；蜃霞t色塊狀為強(qiáng)陽性。

2　結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果詳見表1。

表1　兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果[例(%)]

注：與對照組同檢驗(yàn)方法比較，*P﹤0.01。

2.2兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)和PAS染色診斷效能結(jié)果比較33例NB患兒中29例(87.8%)可見到細(xì)胞成團(tuán)排列，或呈菊花團(tuán)或砌墻排列，大部分可見紫紅色條索狀纖維樣物質(zhì)，是NB細(xì)胞特有的特征之一。對照組中的瘤細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)觀察多數(shù)是單一的，散在的瘤細(xì)胞，個(gè)別有2～3個(gè)聚在一起的現(xiàn)象，無細(xì)胞成團(tuán)排列，或呈菊花團(tuán)或砌墻排列，未見紫紅色條索狀纖維樣物質(zhì)。兩組細(xì)胞形態(tài)和PAS染色診斷效能結(jié)果比較詳見表2。

表2　兩組細(xì)胞形態(tài)和PAS染色診斷效能結(jié)果比較

3　討論

單克隆F3抗體檢測因其靈敏度、特異度都高，是最有效、最準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，主要用于篩查NB。細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合細(xì)胞化學(xué)PAS檢查與F3抗體檢測進(jìn)行效能比較，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合方法檢測中，其靈敏度為87.9%，特異度為95%,一致率為90.6%，大大提高對NB的診斷率。PAS染色可作為NB一種重要的輔助鑒別診斷方法。

小兒NB的檢測方法很多，免疫抗體檢測、超聲影像、骨髓鏡檢等,但是關(guān)于細(xì)胞化學(xué)染色，國外文獻(xiàn)報(bào)道很少，國內(nèi)更為少見，本文嘗試用幾種化學(xué)染色方法對NB進(jìn)行檢測，并比較其靈敏度和特異度，結(jié)果為POX>PAS>NAP。

POX染色主要反映細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶活性，血細(xì)胞所含的過氧化物酶主要是髓過氧化物酶，是粒細(xì)胞含量最多的一種蛋白質(zhì)，本文中53例瘤細(xì)胞經(jīng)POX染色結(jié)果均為陰性，表明所有瘤細(xì)胞中不含有此酶，在細(xì)胞化學(xué)染色中選用此方法，主要用于排除NB，也可鑒別粒細(xì)胞與NB細(xì)胞。操作中需要具有豐富閱片經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)技術(shù)人員細(xì)心計(jì)數(shù)，因試劑標(biāo)準(zhǔn)化，其成本低，有利于普及。PAS主要反映細(xì)胞內(nèi)糖原、粘多糖、黏蛋白的含量。根據(jù)胞質(zhì)中糖原種類及含量多少，呈現(xiàn)粗細(xì)不等紅色顆粒、塊狀物質(zhì)或均勻紅色。NB細(xì)胞中33例陰性，僅有1例弱陽性，胞質(zhì)內(nèi)顆粒呈彌散性淺粉色，該物質(zhì)不是顆粒，可能與機(jī)體感染或發(fā)熱或藥物有關(guān)，原粒細(xì)胞胞質(zhì)顆粒染色較深，呈紫紅色。原幼淋巴細(xì)胞呈紅色粗大顆?；蜃霞t色塊狀。

NAP染色可反映粒細(xì)胞內(nèi)NAP活性。部分腫瘤患兒NAP增高可能與機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)，如發(fā)熱、藥物反應(yīng)等。本文中，NAP染色診斷NB的靈敏度和特異度分別為48.5%和15.0%，說明NB的篩查用此方法不特異。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察是不可替代的重要檢查方法。NB瘤細(xì)胞具有成團(tuán)聚集或呈菊花式排列特點(diǎn)，而一般瘤細(xì)胞無此特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合PAS檢查靈敏度及特異度均高于單獨(dú)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及PAS染色。提示細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)合PAS可提高NB的診斷率，細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法簡單，便于基層醫(yī)院應(yīng)用。

NB有早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，當(dāng)診斷為NB時(shí)應(yīng)把骨髓涂片細(xì)胞學(xué)作為常規(guī)檢查[8]。早期轉(zhuǎn)移骨髓象表現(xiàn)為骨髓增生活躍，粒、紅、巨三系大致正常，少量NB細(xì)胞混雜于正常細(xì)胞之間，骨髓涂片染色鏡檢尋找瘤細(xì)胞[9]顯得十分必要。嚴(yán)重骨轉(zhuǎn)移時(shí)，NB細(xì)胞占優(yōu)勢，易誤認(rèn)為白血病。細(xì)胞形態(tài)學(xué)上瘤細(xì)胞具有成團(tuán)聚集，或呈“菊花團(tuán)”狀聚集，且瘤細(xì)胞間有嗜酸性粉紅色纖維絲狀物[10]，而原淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞無此特點(diǎn)；同時(shí)在NB伴有粒系、紅、巨三系不受抑制的特點(diǎn)，而白血病無論是急性淋細(xì)胞白血病還是急性粒細(xì)胞白血病，骨髓細(xì)胞多為單一一種細(xì)胞，并且有粒、紅、巨三系受抑現(xiàn)象；神經(jīng)母細(xì)胞團(tuán)周圍和散在神經(jīng)母細(xì)胞之間可見紫紅色粗細(xì)不等的條索樣纖維物質(zhì)，而急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病骨髓細(xì)胞形態(tài)中無此現(xiàn)象。這一重要的形態(tài)特點(diǎn)，可作為NB與急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血癥鑒別的重要依據(jù)。當(dāng)疑似NB時(shí)，應(yīng)把骨髓涂片細(xì)胞學(xué)作為常規(guī)檢查，PAS可提高NB的診斷率，其可作為NB診斷和鑒別診斷重要的輔助方法。

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鄭銳(E-mail:shanlinyu33@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.029

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1002-266X(2016)17-0077-03

2015-09-08)