鮑遠　黃俊明　吳穎星　陳琨　程鵬　郭風勁　陳安民

·實驗研究論著·

Yes相關(guān)蛋白通過Wnt/β?catenin信號通路調(diào)控軟骨細胞Sox9表達的研究

鮑遠黃俊明吳穎星陳琨程鵬郭風勁陳安民

目的研究Yes相關(guān)蛋白（Yes?associated protein，YAP）通過Wnt/β?catenin信號通路調(diào)控軟骨細胞Sox9表達的機制。方法用siRNA分別沉默YAP基因和Lats1基因來調(diào)控YAP的活性，通過Real?time PCR檢測軟骨特異性基因和Wnt/β?catenin信號通路下游基因的表達；通過Westernblot檢測GSK3β的磷酸化水平、活化β?catenin的蛋白水平以及Sox9的蛋白水平；并通過阿利新藍染色檢測軟骨細胞外基質(zhì)的分泌情況。用siRNA沉默YAP基因后，再用氯化鋰干預細胞，通過Westernblot檢測Sox9的表達和GSK3β的磷酸化水平。結(jié)果沉默YAP基因后，磷酸化GSK3β和活化β?catenin的蛋白水平減少，c?Myc 和Nanog基因表達減少，Sox9、Col2和Aggrecan基因表達升高，并且軟骨細胞分泌基質(zhì)增多；沉默Lats1基因后，磷酸化GSK3β和活化β?catenin的蛋白水平增加，c?Myc和Nanog基因表達上調(diào)，Sox9、Col2和Aggre?can基因表達減少，并且軟骨細胞分泌基質(zhì)減少。此外，氯化鋰可以阻斷沉默YAP引起的Sox9表達上調(diào)。結(jié)論YAP通過Wnt/β?catenin信號通路調(diào)控軟骨細胞Sox9的表達。

軟骨細胞；細胞分化；Yes相關(guān)蛋白；信號傳導；基因表達調(diào)控

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、神經(jīng)、淋巴管和軟骨前體細胞，再生修復能力十分有限［1，2］。創(chuàng)傷導致的關(guān)節(jié)軟骨缺損若長期存在，易進展為骨性關(guān)節(jié)炎并引起關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。近年來，軟骨組織工程興起，為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復帶來新的希望［3］。然而，研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在體外培養(yǎng)時很容易發(fā)生去分化而成為肥大軟骨細胞，移植后由于失去分泌軟骨基質(zhì)的功能，無法形成正常的軟骨組織［4］。因此，如何維持離體軟骨細胞的正常表型是軟骨組織工程修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的重大挑戰(zhàn)。

Yes相關(guān)蛋白（Yes?associated protein，YAP）是一種調(diào)控細胞增殖、生長和分化的轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子［5，6］，Hippo信號通路下游的效應蛋白。在哺乳動物中，Hippo信號通路被激活后，Lats將下游的YAP磷酸化而使其滯留在胞質(zhì)中，從而使YAP的功能受到抑制；通路被抑制后，Lats的活性降低使YAP的磷酸化程度減少，非磷酸化的YAP進入細胞核與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最終啟動目的基因的表達［7］。在胚胎干細胞中，YAP高水平的表達有助于促進干細胞增殖并保持未分化的狀態(tài)［8］；在間充質(zhì)干細胞（MSCs）中，YAP過表達會抑制它向軟骨細胞分化，因此YAP是MSCs成軟骨分化的負性調(diào)控因子［9］。

Sox9是軟骨細胞分化過程中的一種必不可少的轉(zhuǎn)錄因子［10］，可抑制軟骨細胞去分化［11，12］。研究證明，Sox9和β?catenin相互作用共同調(diào)控軟骨細胞的分化［13］。β?catenin是經(jīng)典Wnt信號通路下游的效應蛋白［14］，過表達β?catenin（或通過氯化鋰抑制β?catenin的降解）能導致軟骨細胞去分化而成為肥大軟骨細胞，降低β?catenin的表達則可促進軟骨細胞分化并抑制軟骨細胞發(fā)生肥大現(xiàn)象［15］。有學者研究指出，β?catenin能與Sox9的C端轉(zhuǎn)錄激活域結(jié)合，從而抑制Sox9啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄［13］。

近年來有文獻報道，YAP參與Wnt/β?catenin信號通路的調(diào)節(jié)［16］。胞質(zhì)中的YAP能與β?catenin降解復合體結(jié)合，從而增加復合體的活性并促進β?catenin的降解；而YAP激活后與復合體脫離并進入胞核，從而抑制復合體的活性并激活β?catenin［17］。因此我們推測，YAP通過Wnt/β?catenin信號通路對Sox9的表達進行調(diào)控。

材料與方法

一、實驗材料

7日齡SD大鼠（華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，中國），Ⅰ型膠原酶、凝膠配置試劑盒、RI?PA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液5×、GAPDH抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國），胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），DMEM/F12（HyClone公司，美國），總RNA提取試劑盒、SYBR Green試劑（Azanno公司，瑞典），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡上海生物科技有限公司，中國），非磷酸化β?catenin（Active β?catenin）、YAP、磷酸化YAP抗體（CST公司，德國），Sox9、Lats1抗體（Abcam公司，英國），siRNA及riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司，中國），電泳儀、電轉(zhuǎn)膜儀、實時熒光定量PCR儀和凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio?Rad公司，美國）。

二、實驗方法

（一）細胞的分離培養(yǎng)

將7日齡SD大鼠處死后，在無菌條件下剪下雙下肢，剔除皮膚肌肉等軟組織。取脛骨上端靜止層的生長板軟骨，用顯微剪刀將其剪成1～2 mm的碎塊，加入0.25%的胰酶在37℃水浴中消化20 min，離心棄去上清后再加入0.2%的Ⅰ型膠原酶，最后將其放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)消化8 h。消化得到的軟骨細胞通過離心獲?。? 200 r/min，5 min），棄去上清后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸，再放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。當細胞融合度達到80%～90%時，用胰酶消化并按1∶3的比例傳代，備用。

（二）siRNA沉默Lats1和YAP基因

軟骨細胞經(jīng)過胰酶消化后，接種至6孔板，每孔細胞數(shù)約為20萬個，次日待細胞貼壁后進行siRNA轉(zhuǎn)染。

（1）稀釋RNA，取5 μl siRNA（20 μmol/L）儲存液加入到120 μl riboFECTTMCPbuffer（1×）中，輕輕混勻。

（2）混合液制備，加入12 μl riboFECTTMCP Re?agent，輕輕吹打混勻，室溫孵育10 min。

（3）棄去6孔板內(nèi)陳舊培養(yǎng)基后，加入1 863 μl新鮮培養(yǎng)基，再加入上述混合液137 μl，輕輕搖勻。

轉(zhuǎn)染成功后，通過Real?time PCR驗證最佳的沉默序列（表1）。

表1　沉默Lats1和YAP基因的siRNA序列

（三）Westernblot檢測蛋白表達

按照上述轉(zhuǎn)染步驟分別將Lats1和YAP基因沉默，96 h后提取蛋白。用RIPA裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液后，在低溫高速離心機中離心20 min （4℃，12 000×g）。然后吸取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定其蛋白濃度，剩余上清液按4∶1的比例加入SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液，充分混勻后在沸水浴中煮5 min，室溫冷卻后置于-20℃保存。

蛋白樣本各取20 μg加入10%的SDS?PAGE凝膠中，通過電泳把不同分子量的蛋白分離。在恒流300 mA持續(xù)2 h的條件下，將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的PVDF膜上。用5%的BSA（TBST溶液配制）在室溫下封閉2 h。然后PVDF膜用規(guī)定稀釋比例的一抗在4℃下孵育過夜。一抗孵育后，將PVDF膜用TBST溶液洗3次，每次在水平搖床上搖10 min。然后將PVDF膜在室溫下孵育相應二抗1 h，再用TBST洗3次，每次在水平搖床上搖10 min。最后目的蛋白用ECL和凝膠成像分析系統(tǒng)檢測，并用內(nèi)置軟件（Image Lab 5.1版本）處理圖像結(jié)果。

（四）Real?time PCR檢測基因表達

按照上述轉(zhuǎn)染步驟分別將Lats1和YAP基因沉默，72 h后用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，總RNA濃度由分光光度計測得。取1 μg各樣本的RNA分別加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的反應體系，在逆轉(zhuǎn)錄儀器中進行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，置于-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為：42℃，15 min；95℃，5 min；4℃，30 min。取樣本cDNA進行Real?time PCR，反應體系為10 μl，包括0.5 μl樣本、4 μl無RNA酶水、0.5 μl引物和5 μl SYBR Green。反應程序為：95℃預變性2 min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，該步驟循環(huán)40次；溶解曲線。

RNA相對表達量由內(nèi)置軟件（Bio?Rad iQ5光學系統(tǒng)軟件）計算得出。

（五）阿利新藍染色

按照上述轉(zhuǎn)染步驟分別將Lats1和YAP沉默，于7 d后進行阿利新藍染色。染色步驟：①棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍后用4%多聚甲醛固定30 min；②棄去4%多聚甲醛，用PBS洗3遍，再用阿利新藍染液染30 min；③PBS洗3遍后，在顯微鏡下觀察。

圖1　沉默YAP基因后檢測軟骨特異性基因及Wnt/β?catenin信號通路下游基因的表達　a：用Real?time PCR檢測3條YAP基因沉默序列的沉默效果，siYAP?1的沉默效果最好；b：沉默YAP基因后，Wnt/β?catenin信號通路下游基因c?Myc和Nanog的表達明顯減少；c：沉默YAP基因后，軟骨特異性基因Sox9、Col2和Aggrecan的表達顯著升高

結(jié)果

一、沉默YAP基因促進軟骨特異性基因的表達

分別用siYAP?1、siYAP?2、siYAP?3轉(zhuǎn)染軟骨細胞，通過Real?time PCR檢測YAP基因沉默的效果。結(jié)果顯示siYAP?1的沉默效果最好（圖1a）。

然后用siYAP?1轉(zhuǎn)染軟骨細胞，通過Real?time PCR檢測Wnt/β?catenin信號通路下游基因和軟骨特異性基因的表達情況，結(jié)果顯示c?Myc和Nanog基因的表達下調(diào)（圖1b），提示W(wǎng)nt/β?catenin信號通路的活性受抑制；同時Col2、Sox9和Aggrecan基因的表達上調(diào)（圖1 c）。

用Westernblot檢測GSK3β蛋白的磷酸化水平（GSK3β磷酸化后，GSK3激酶活性被抑制）以及活化β?catenin和Sox9的蛋白水平。結(jié)果顯示，沉默YAP基因?qū)е翯SK3β的磷酸化水平降低，活化β?catenin蛋白水平減少，而Sox9蛋白水平增多（圖2）。此外，阿利新藍染色顯示沉默YAP基因后細胞外基質(zhì)的染色面積大于對照組（圖3），說明軟骨細胞分泌基質(zhì)增加。

二、沉默Lats1基因抑制軟骨特異性基因的表達

分別用siLats1?1、siLats1?2、siLats1?3轉(zhuǎn)染軟骨細胞，通過Real?time PCR檢測Lats1基因沉默的效果，結(jié)果顯示siLats1?2的沉默效果最好（圖4a）。

然后用siLats1?2轉(zhuǎn)染軟骨細胞，通過Real?time PCR檢測Wnt/β?catenin信號通路下游基因和軟骨特異性基因的表達情況，結(jié)果顯示c?Myc和Nanog基因的表達明顯上調(diào)（圖4b），提示W(wǎng)nt/β?catenin信號通路被激活；同時Col2、Sox9和Aggrecan基因的表達減少（圖4 c）。用Westernblot檢測YAP和GSK3β蛋白的磷酸化水平以及活化β?catenin和Sox9的蛋白水平，結(jié)果顯示，沉默Lats1基因?qū)е耏AP蛋白的磷酸化水平降低（說明YAP蛋白活性升高）而GSK3β的磷酸化水平升高，同時活化β?catenin蛋白水平增多，而Sox9蛋白水平減少（圖5）。此外，阿利新藍染色顯示沉默Lats1基因后細胞外基質(zhì)的染色面積小于對照組（圖3）。

三、沉默YAP引起的Sox9表達上調(diào)可被氯化鋰抑制

陰性對照（NC）組細胞和YAP基因沉默（siYAP）組細胞分別用GSK3激酶抑制劑氯化鋰干預3 d，通過Westernblot檢測磷酸化GSK3β和Sox9的蛋白水平，結(jié)果顯示，單純沉默YAP基因時，GSK3β的磷酸化水平減少，而Sox9的蛋白表達增加。氯化鋰作用后，兩組細胞的GSK3β磷酸化水平均明顯升高，即GSK3激酶的活性被抑制，而Sox9的表達均明顯減少（圖6）。說明氯化鋰可通過抑制GSK3激酶的活性來阻斷沉默YAP基因引起的Sox9表達上調(diào)。

圖3　阿利新藍染色檢測軟骨基質(zhì)的分泌情況（×100） 沉默YAP基因后，軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)增多；而沉默Lats1基因后，軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)減少

圖4　沉默Lats1基因后檢測軟骨特異性基因及Wnt/β?catenin信號通路下游基因的表達　a：用Real?time PCR檢測3條Lats1基因沉默序列的沉默效果，可見siLats1?2的沉默效果最好；b：沉默Lats1基因后，Wnt/β?catenin信號通路下游基因c?Myc和Nanog的表達明顯升高；c：沉默Lats1基因后，軟骨特異性基因Sox9、Col2和Aggrecan的表達顯著減少

討論

體外培養(yǎng)的軟骨細胞容易發(fā)生去分化是阻礙軟骨組織工程發(fā)展的難題，因此揭示體外軟骨細胞去分化的機制有助于解決這一問題。在本研究中，我們通過沉默Lats和YAP基因的方法來調(diào)節(jié)YAP蛋白的活性，同時觀察軟骨細胞特異性基因Sox9、Col2和Aggrecan的表達情況，從而證明YAP蛋白活性與軟骨細胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象之間的關(guān)聯(lián)；并且通過觀察Wnt/β?catenin信號通路的變化，揭示YAP調(diào)控Sox9表達的可能機制。

圖5　沉默YAP基因后，p?GSK3β和Active β?catenin的蛋白水平升高，說明β?catenin降解復合體活性被抑制，而Wnt/β?catenin通路被激活，同時，Sox9的表達減少

圖6　陰性對照組細胞和沉默YAP基因的細胞分別用GSK3激酶抑制劑氯化鋰干預，檢測GSK3β激酶的活性以及Sox9的表達　單純沉默YAP基因時，GSK3β的磷酸化水平減少，而Sox9的表達增加；氯化鋰作用后，兩組細胞GSK3β的磷酸化水平均升高，而Sox9表達均減少；說明氯化鋰可通過抑制GSK3激酶的活性來阻斷沉默YAP基因引起的Sox9表達上調(diào)

研究結(jié)果顯示，沉默Lats1基因?qū)е耂ox9的表達明顯減少，而沉默YAP基因?qū)е耂ox9的表達明顯增多。Lats1蛋白是Hippo信號通路中的具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，能使YAP蛋白中第127位點的絲氨酸殘基磷酸化，從而抑制YAP蛋白的活性使其定位在胞質(zhì)中［18］。沉默Lats1基因后，YAP蛋白的磷酸化程度減少且活性升高；而沉默YAP基因后，YAP蛋白表達減少因此活性被抑制。該結(jié)果表明YAP蛋白的活性與Sox9的表達具有相關(guān)性。細胞在體外培養(yǎng)時，改變基質(zhì)的硬度可以調(diào)節(jié)YAP蛋白的活性。增加基質(zhì)硬度可導致YAP蛋白活性增加，反之，YAP蛋白活性減小。有學者通過改變基質(zhì)硬度來證明YAP蛋白活性與Sox9表達水平之間的關(guān)系，其結(jié)論與我們一致［19］。當細胞增殖活躍時，YAP的活性處于較高的狀態(tài)，所以我們推測，軟骨細胞在體外增殖過程中，YAP活性增高導致Sox9表達減少，最終導致軟骨細胞去分化而失去軟骨表型。

然后，我們研究了YAP調(diào)控Sox9表達的機制。通過沉默Lats1基因來上調(diào)YAP的活性，結(jié)果顯示GSK3β的磷酸化水平增高（即GSK3激酶的活性被抑制），活化β?catenin的蛋白水平增加，以及Wnt信號通路下游基因的表達增加；通過沉默YAP基因來抑制YAP的活性，結(jié)果顯示GSK3β的磷酸化水平降低（即GSK3激酶的活性升高），活化β?catenin的蛋白水平降低，以及Wnt信號通路下游基因的表達減少。該研究結(jié)果證明上調(diào)YAP的活性可以激活Wnt/β?catenin信號通路，而降低YAP的活性可以抑制Wnt/β?catenin信號通路。Azzolin等［17］認為，YAP調(diào)控Wnt/β?catenin信號通路的位點在β?catenin降解復合體，胞漿中的YAP與復合體結(jié)合并招募β?TrCP，從而促進磷酸化β?catenin的降解來抑制β?catenin的活性。然而我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，改變YAP的活性后，GSK3激酶的活性也隨之變化，因此我們推測YAP可能是通過影響GSK3激酶的活性來調(diào)控β?catenin的活性，進而調(diào)控Sox9的表達。為了進一步證明這個觀點，我們在沉默YAP基因后用GSK3激酶抑制劑氯化鋰作用細胞。結(jié)果顯示單純沉默YAP基因時，GSK3β的磷酸化水平減少（即GSK3激酶活性升高），且Sox9蛋白水平增加；然而，當沉默YAP基因同時給予氯化鋰作用，此時GSK3β的磷酸化水平增加（即GSK3激酶活性降低），并且Sox9蛋白水平減少。說明氯化鋰可通過抑制GSK3激酶的活性來阻斷沉默YAP基因引起的Sox9表達上調(diào)，因此證明YAP通過影響GSK3激酶的活性來調(diào)控Wnt/β?catenin信號通路，進而調(diào)節(jié)Sox9的表達。有關(guān)YAP在Wnt/β?catenin信號通路中的直接作用位點，本研究未能證明，需要進一步探索。

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Yes?associated protein regulates the expression of Sox9 in chondrocytesby Wnt/β?catenin signaling pathway.

BAO Yua
n，HUANG Junming，WU Yingxing，CHEN Kun，CHENG Peng，GUO Fengjin，CHENanmin. Department of Orthopaedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Scienceand Tech?nology，Wuhan 430030，China

CHENanming，E?mail：anminchen@hust.edu.cn

ObjectiveTo investigate the mechanisms of Sox9 regulatedby Yes?associated protein （Yap）in chondrocytes via Wnt signaling pathway.MethodsYap or Lats1 was knocked down with small inter?fering RNA to regulate theactivity of Yap.Genes related to Wnt/β?catenin signaling pathwayand cartilage?spe?cific genes were detectedby Real?time PCR.Wnt/β?catenin signaling was determinedby detection of p?GSK3βandactive β?catenin via Westernblottingand Sox9 wasalso detectedby Westernblotting.The cartilage?specif?ic extracellular matrix wasassessedbyalcianblue staining.Chondrocytes with Yap knockdown were treated with lithium chloride，then p?GSK3βand Sox9 were detectedby Westernblotting.ResultsAfter knockdown of Yap，Wnt signaling pathway was inhibited，leading to increased expression of Sox9，Col2andaggrecanand enhanced secretion of the cartilage?specific extracellular matrix.After Lats1 was knocked down，the obtained re?sult was opposite completely.Moreover，lithium chloride couldblock the up?regulation of Sox9 expression in?ducedby knockdown of Yap.ConclusionYap regulates the expression of Sox9 in chondrocytesby Wnt signal?ing pathway.

Chondrocytes；Cell differentiation；Yes?associated protein；Signal transduction；Gene ex?pression regulation

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.03.012

國家自然科學基金（81171696，81472082）

430030武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院骨科

陳安民，E?mail：anminchen@hust.edu.cn

2015?12?11）