李秀英，葉　云（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州646000）

·論著·

β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及機(jī)制*

李秀英，葉云△（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州646000）

目的探討β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及相關(guān)機(jī)制。方法采用氧化低密度脂蛋白（oxLDL）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞為泡沫細(xì)胞模型，給予β-葡聚糖進(jìn)行干預(yù)。通過油紅O染色及酶比色法定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯水平的變化；采用Western blotting及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ABCA1）及其mRNA表達(dá)的影響并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)采用蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理細(xì)胞4、8、12 h測(cè)定ABCA1穩(wěn)定性。結(jié)果與oxLDL處理組比較，β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)的抑制率為 （90.0±1.8）%，oxLDL處理組巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯及總膽固醇與β-葡聚糖處理組 （2.5、5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖+oxLDL共同孵育）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖處理組巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1及其mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。β-葡聚糖（10.0 μg/mL）與CHX共同處理組在細(xì)胞孵育4、8、12 h時(shí)，ABCA1降低水平均小于CHX處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論β-葡聚糖通過增加ABCA1的表達(dá)水平及增強(qiáng)其穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的排出，最終抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。

β葡聚糖類；巨噬細(xì)胞；膽固醇；泡沫細(xì)胞；膽固醇酯；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈疾病的主要危險(xiǎn)因素，是發(fā)達(dá)國(guó)家人群致死、致殘的首要病因，在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)生率也逐漸呈增高趨勢(shì)［1］。脂質(zhì)含量豐富的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化損傷形成的標(biāo)志，也是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化損傷的原因［2］。巨噬細(xì)胞泡沫化與巨噬細(xì)胞大量攝取氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出障礙及細(xì)胞內(nèi)大量蓄積膽固醇酯（CE）有關(guān)［3］。膽固醇逆轉(zhuǎn)錄受體ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 A1（ABCA1）負(fù)責(zé)將巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出［4］。有研究結(jié)果顯示，增加ABCA1的表達(dá)可以抑制泡沫細(xì)胞的形成，并最終延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［5-6］。

β-葡聚糖主要來源于新鮮的食品，如燕麥、啤酒酵母等。有研究顯示，β-葡聚糖具有降低血脂、抗氧化、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用［7］，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬從ABCA1表達(dá)變化的角度探討β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇排出的影響，為β-葡聚糖抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞RAW264.7巨噬細(xì)胞（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)），由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.1.2試劑油紅O（規(guī)格：5 g，批號(hào)：215-295-3）、甘油明膠（規(guī)格：100 mL，批號(hào)：G5516，純度：≥99%）、β-葡聚糖（規(guī)格：25 mg，批號(hào)：P1120100）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ABCA1（ab18180）、β-actin（ab8226）抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基（規(guī)格：500mL，批號(hào)：1740266）、胎牛血清（規(guī)格：200 mL，批號(hào)：150202）購(gòu)自Gibco公司；oxLDL（規(guī)格：2 mg，批號(hào)：2015-12-22）購(gòu)自廣州奕源生物公司。

1.1.3儀器H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；ESCO垂直流超凈工作臺(tái)（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；BBD6220 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）；IX71-A21PH倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；DHP-9402電熱恒溫培養(yǎng)箱［德創(chuàng)科儀（北京）科技有限公司］；Fluoroskan Ascent FL酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Forma公司）；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及凍存RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，使用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清置于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，當(dāng)傳至第5代時(shí)可將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、離心、稀釋細(xì)胞至密度為2×106mL-1，分裝于凍存管中，置于-80℃冰箱中，過夜后轉(zhuǎn)至液氮罐保存。

1.2.2噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活性RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔板中，將細(xì)胞分成對(duì)照組及β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）干預(yù)組。每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后，β-葡聚糖干預(yù)組分別加入濃度為2.5、5.0、10.0 μg/mL的β-葡聚糖，培養(yǎng)24 h后，加入20 μL MTT孵育4 h，加入二甲亞砜（DMSO）120 μL，振蕩10 min，在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光度A570nm。

1.2.3油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分為對(duì)照組、oxLDL處理組（100 μg/mL oxLDL孵育24 h）、β-葡聚糖處理組（5.0 μg/mL β-葡聚糖及100 μg/mL oxLDL共同孵育24 h）。細(xì)胞孵育結(jié)束后，棄上清液，10%多聚甲醛固定30 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕洗1次后，油紅O染色10 min，再用60%異丙醇洗滌細(xì)胞1次（孵育時(shí)間10 s），棄異丙醇，PBS輕輕洗1次后顯微鏡下照相。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）及CE含量測(cè)定將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于 6孔板內(nèi)，分為對(duì)照組、oxLDL處理組（100 μg/mL oxLDL孵育24 h）、β-葡聚糖處理組（2.5、5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖及100 μg/mL oxLDL共同孵育24 h），細(xì)胞孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，加入80 μL無水乙醇，超聲提取10 s后，10 000 r/min離心5 min，吸上清液至EP管中，按照試劑盒說明書分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC及CE含量。

1.2.5Western blotting檢測(cè)ABCA1的表達(dá)及其蛋白穩(wěn)定性（1）ABCA1表達(dá)量的測(cè)定：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對(duì)照組、β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）處理組，孵育24 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。25 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合后煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳100 V恒壓2 h，濕轉(zhuǎn)300 mA恒流1.5 h，5%脫脂奶粉封膜1 h，磷酸鹽緩沖液+0.1%吐溫-20（PBST）漂洗 3次后分別加入一抗和 β-actin 4℃孵育過夜，PBST漂洗3次，37℃二抗 （1∶1000稀釋）反應(yīng)1 h后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)量。（2）對(duì)于ABCA1穩(wěn)定性的測(cè)定：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組、蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理組、10.0 μg/mL β-葡聚糖與2.0 μg/mL CHX共同處理組，孵育時(shí)間為4、8、12 h，收集孵育后的細(xì)胞，按照上述方法檢測(cè)ABCA1的變化。

1.2.6熒光定量PCR檢測(cè)ABCA1 mRNA表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對(duì)照組、β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）處理組，孵育 24 h后，用Trizol提取細(xì)胞RNA，經(jīng)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再通過引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。所用引物包括：β-actin上游：5′-TTGTCCCTGTATGCCTCTGG-3′；βactin下游：5′-TTGTCCCTGTATGCCTCTGG-3′；ABCA1上游：5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′，ABCA1下游：5′-CCCGGAAACGCAAGTCC-3′，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用β-actin的mRNA標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用雙尾t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1不同質(zhì)量濃度β-葡聚糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響β-葡聚糖質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0 μg/mL時(shí)，檢測(cè)所得A570nm值分別為3.68±0.06、3.68±0.06、3.69± 0.07，與對(duì)照組（3.65±0.05）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2.5、5.0、10.0 μg/mL的β-葡聚糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活性無影響，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取的β-葡聚糖質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0 μg/mL。

2.2不同質(zhì)量濃度β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響oxLDL處理組巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)CE及TC含量明顯增加，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；oxLDL+β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）處理組TC及CE含量與oxLDL處理組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　不同質(zhì)量濃度β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響（±s，mg/dL，n=3）

表1　不同質(zhì)量濃度β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響（±s，mg/dL，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與oxLDL處理組比較，bP＜0.05。

膽固醇對(duì)照組　o x L D L處理組o x L D L + 2 . 5 μ g / m L β-葡聚糖處理組o x L D L + 5 . 0 μ g / m L β-葡聚糖處理組o x L D L + 1 0 . 0 μ g / m L β-葡聚糖處理組T C C E 3 6 2 . 0 ± 1 9 . 0 2 1 6 . 0 ± 1 2 . 0 6 5 1 . 6 ± 2 0 . 0a3 2 4 . 0 ± 1 5 . 0a3 9 8 . 2 ± 2 8 . 0b2 5 9 . 2 ± 2 0 . 0b3 2 5 . 8 ± 2 5 . 0b2 4 1 . 9 ± 2 8 . 0b2 8 9 . 6 ± 3 0 . 0b1 9 4 . 4 ± 1 7 . 0b

2.3β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響

對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)聚集的脂質(zhì)較少，oxLDL處理組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多，油紅O染色后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的（5.00± 0.07）倍，與oxLDL處理組比較，5.0 μg/mL β-葡聚糖處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集減少，油紅O染色后陽(yáng)性細(xì)胞減少（90.0±1.8）%。見圖1。

圖1　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響（油紅O染色，400×）

2.4β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1及其mRNA表達(dá)的影響2.5、5.0、10.0 μg/mLβ-葡聚糖處理組ABCA1表達(dá)顯著高于對(duì)照組，5.0、10.0μg/mLβ-葡聚糖處理組ABCA1 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），見表2、3，圖2。

表2　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響（±s，n=3）

表2　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01。

組別對(duì)照組β-葡聚糖處理組（μ g / m L ）2 . 5 5 . 0 1 0 . 0 A B C A 1 / β -a c t i n 1 . 5 0 ± 0 . 0 5 1 . 8 0 ± 0 . 0 6a1 . 9 5 ± 0 . 0 8a2 . 2 5 ± 0 . 0 4a

表3　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=3）

表3　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組β-葡聚糖處理組（μ g / m L ）2 . 5 5 . 0 1 0 . 0 A B C A 1 m R N A 1 . 7 0 ± 0 . 0 6 1 . 8 7 ± 0 . 0 5 1 . 9 5 ± 0 . 0 7a2 . 1 0 ± 0 . 0 8a

圖2　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響

2.5β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞 ABCA1穩(wěn)定性的影響β-葡聚糖（10.0 μg/mL）與CHX共同處理組在細(xì)胞孵育4、8、12 h時(shí)，ABCA1降低水平均小于CHX處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖3。

表4　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1穩(wěn)定性的影響（±s，n=3）

表4　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1穩(wěn)定性的影響（±s，n=3）

注：與CHX處理組相同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05。

組別　0 h　4 h　8 h　1 2 h C H X處理組C H X + β-葡聚糖處理組1 . 3 0 ± 0 . 0 4 1 . 3 0 ± 0 . 0 4 0 . 3 9 ± 0 . 0 3 0 . 6 5 ± 0 . 0 5a0 . 2 6 ± 0 . 0 6 0 . 5 2 ± 0 . 0 3a0 . 2 4 ± 0 . 0 2 0 . 3 0 ± 0 . 0 3a

圖3　β-葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1穩(wěn)定性的影響

3　討　論

已有研究表明，β-葡聚糖有降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用［7］。但β-葡聚糖是否減少巨噬細(xì)胞內(nèi)CE的聚集及相關(guān)機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，β-葡聚糖通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)受體ABCA1的表達(dá)及增強(qiáng)ABCA1蛋白穩(wěn)定性，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)CE的聚集，抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的排出在維持巨噬細(xì)胞膽固醇處于平衡狀態(tài)過程中起著重要作用［4］。本研究結(jié)果證明了β-葡聚糖通過減少巨噬細(xì)胞內(nèi)CE及TC含量，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取，從而抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。此外，β-葡聚糖顯著增加巨噬細(xì)胞ABCA1及其mRNA的表達(dá)。量化β-葡聚糖對(duì)ABCA1變化的影響發(fā)現(xiàn)，10.0 μg/mL β-葡聚糖增加ABCA1的表達(dá)量（50%，2.25/1.50）大約為β-葡聚糖介導(dǎo)的ABCA1 mRNA升高量（24%，2.10/1.70）及β-葡聚糖穩(wěn)定ABCA1表達(dá)量（25%，0.30/0.24）的總和，該結(jié)果表明β-葡聚糖是通過調(diào)控ABCA1逆轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平增加ABCA1的表達(dá)。ABCA1是巨噬細(xì)胞排出膽固醇的主要膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)受體［4］。此外，ABCA1在維持巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的重要作用已經(jīng)得到公認(rèn)［8-9］。由ABCA1的功能可知，β-葡聚糖增加ABCA1表達(dá)的作用與β-葡聚糖減少巨噬細(xì)胞內(nèi)CE及TC含量，最終抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成有關(guān)。

綜上所述。本研究提供了β-葡聚糖抗動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制，同時(shí)也為抗動(dòng)脈粥樣硬化提供了治療靶點(diǎn)。

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Effects of β-glucan on reverse cholesterol transport of macrophage-derived foam cells and its mechanism*

Li Xiuying，Ye Yun△（Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo explore the effects of β-glucan on the reverse cholesterol transport of macrophage-derived foam cells and its relative mechanism.MethodsOxidized low-density lipoprotein（oxLDL）induced RAW264.7 macrophages were adopted as the foam cells model for giving the β-glucan intervention.The Oil-red O staining and enzymatic colorimetry were employed to examine the changes of intracellular total cholesterol and cholesteryl ester；Western blotting and real-time PCR were used to detect the effect of β-glucan on the expression on ATP-binding cassette transporter protein A1（ABCA1）and mRNA in macrophages.The obtained data were statistically analyzed.The protein synthesis inhibitors cycloheximide（CHX）processed cell 4，8，12 h，thus，deter minated ABCA1 stability.ResultsThe inhibiting rate of β-glucan on macrophage′lipid uptake was（90.0± 1.8）%，total cholesterol and cholesteryl ester levels had statistical difference between the oxLDL group and the co-incubation groups of oxLDL and 5.0，10.0 μg/mL β-glucan（P＜0.05）；the expression of ABCA1 and mRNA had statistical differences between the 5.0，10.0 μg/mL β-glucan groups and the control group（P＜0.01 or 0.05）.β-glucan（10.0 μg/mL）and CHX common treatment group in cell incubation 4，8，12 h，ABCA1 lower level less than CHX treatment group，the difference was statistically significant （P＜0.05）.Conclusionβ-glucan promotes the intracellular cholesterol discharge and finally inhibits the formation of macrophagederived foam cells by enhancing ABCA1 expression and protein stability.

Beta-glucans；Macrophages；Cholesterol；Foam cells；Cholesterol esters；Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.14.001

A

1009-5519（2016）14-2117-03

國(guó)家青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81500357）；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院課題項(xiàng)目（15044）；西南醫(yī)科大學(xué)課題項(xiàng)目（2015-03-10）。

李秀英（1987-），博士研究生，主管藥師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究。

△，E-mail：yeyun8622@163.com。

（2016-04-07）