瞿　奇，何小亮，張?jiān)讫?，王　坤，張秀萍?.廣州市第六中學(xué)，廣東510300；.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，廣東廣州510515）

·論著·

雷帕霉素對(duì)帕金森病小鼠神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的研究*

瞿奇1#，何小亮2#，張?jiān)讫?，王坤1△，張秀萍3△
（1.廣州市第六中學(xué)，廣東510300；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，廣東廣州510515）

目的研究雷帕霉素對(duì)帕金森?。≒D）小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。方法采用懸掛試驗(yàn)和爬桿試驗(yàn)檢測(cè)雷帕霉素對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)行為障礙的改善作用，免疫組織化學(xué)檢測(cè)雷帕霉素對(duì)PD小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶、α-突觸核蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果雷帕霉素明顯改善了PD小鼠運(yùn)動(dòng)行為缺陷，提高了酪氨酸羥化酶的表達(dá)，降低了α-突觸核蛋白的表達(dá)。結(jié)論雷帕霉素對(duì)PD小鼠具有明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

帕金森?。欢喟桶?；神經(jīng)元；突觸蛋白類(lèi)；西羅莫司

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種中老年常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床癥狀主要以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌張力增高和姿勢(shì)平衡障礙為主，目前，PD病因仍不甚明確。尋找針對(duì)PD新的治療靶點(diǎn)和有效藥物對(duì)改善PD患者生活質(zhì)量具有重要意義。雷帕霉素（西羅莫司）是從鏈球菌中提取的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物，具有免疫抑制作用。有研究表明，雷帕霉素可促進(jìn)阿爾茲海默病模型中淀粉樣蛋白的清除，顯示了該藥具有明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)［1-5］。雷帕霉素是否可改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)行為障礙及提高酪氨酸羥化酶的表達(dá)，從而對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)是本研究的關(guān)鍵所在。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只雄性C57BL小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，抗酪氨酸抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，α-突觸核蛋白購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3主要儀器冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）、倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1PD模型制備及雷帕霉素治療參照文獻(xiàn)［6-7］的方法腹腔注射MPTP制備PD小鼠模型，同時(shí)應(yīng)用雷帕霉素進(jìn)行治療。將24只（每只體質(zhì)量25 g）C57BL小鼠分為治療組、對(duì)照組、雷帕霉素組和PD組，每組6只。治療組注射 MPTP及雷帕霉素，給藥方法：注射MPTP前2 d（第1～2天）注射雷帕霉素5 mg/（kg·d），每天1次，共2 d；然后同時(shí)給予MPTP、雷帕霉素5 d（第3～7天），上午9：00注射MPTP 30 mg/kg，晚上21：00注射雷帕霉素5 mg/（kg·d）；注射MPTP 5 d后繼續(xù)單獨(dú)注射雷帕霉素5mg/（kg·d）4 d（第8～11天），每天1次。對(duì)照組第1～2天及第8～11天注射生理鹽水0.1 mL/10 g，每天1次，第3～7天上午9：00和晚上21：00注射生理鹽水0.1 mL/10 g，各1次。雷帕霉素組：第1～2天及第8～11天每天注射雷帕霉素1次（劑量與治療組相同），第3～7天上午9：00注射生理鹽水（劑量與對(duì)照組相同），晚上21：00注射雷帕霉素。PD組：第1～2天及第8～11天每天注射生理鹽水1次（劑量與對(duì)照組相同），第3～7天上午9：00注射MPTP（劑量與治療組相同），晚上21：00注射生理鹽水。末次注射1 d后于大腦不同部位取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2行為學(xué)試驗(yàn)

1.2.2.1爬桿試驗(yàn)將一直徑為2 cm的泡沫塑料小球固定于一根長(zhǎng)50 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏2層紗布以防打滑。持小鼠尾部將其頭向下置于竿頂（以小鼠雙后肢置于球上為準(zhǔn)），讓其自然爬下，小鼠自站于竿頂至雙前肢接觸竿底平臺(tái)為爬完全長(zhǎng)。在造模后各組分別取一定數(shù)量小鼠進(jìn)行爬桿試驗(yàn)，觀(guān)察小鼠行為學(xué)改變，記錄爬竿時(shí)間。

1.2.2.2懸掛試驗(yàn)自制有機(jī)玻璃試驗(yàn)箱，水平放置的金屬桿直徑1.5 mm，距地面30 cm，金屬桿上方1 cm加蓋，以避免小鼠翻坐于金屬桿上，試驗(yàn)中小鼠懸掛于金屬桿上，記錄落地前時(shí)間。每次檢測(cè)間隔時(shí)間為1 min，共檢測(cè)5次，取平均值。

1.2.3免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色將小鼠深度麻醉后快速取腦，固定過(guò)夜。-25℃用冰凍切片機(jī)切成10 μm厚腦片，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗3次，每次5 min，封閉液（PBS、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚、5%牛血清清蛋白）室溫孵育15 min后加入一抗。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h，二氨基聯(lián)苯氨染色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀(guān)察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析（One Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1四組小鼠懸掛試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)結(jié)果比較PD組小鼠出現(xiàn)立毛、震顫等癥狀，治療組小鼠運(yùn)動(dòng)行為缺陷明顯改善，懸掛時(shí)間明顯延長(zhǎng)（圖1A），爬到桿底所用時(shí)間明顯縮短（圖1B），與PD組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

圖1　四組小鼠懸掛試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2四組小鼠腦組織酪氨酸羥化酶表達(dá)水平比較治療組小鼠腦組織酪氨酸羥化酶表達(dá)水平較PD組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2　四組小鼠腦組織酪氨酸羥化酶表達(dá)水平比較（免疫組化，50×）

2.3四組小鼠腦組織α-突觸核蛋白表達(dá)水平比較治療組小鼠腦組織α-突觸核蛋白表達(dá)水平較PD組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3　四組小鼠腦組織α-突觸核蛋白表達(dá)水平比較（免疫組化，400×）

3　討　論

PD是僅次于阿爾茲海默病的中老年常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，據(jù)流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)目前PD患者約200萬(wàn)，約占世界PD患者總數(shù)的2/5，我國(guó)每年新增PD患者近10萬(wàn)人，65歲以上人群患病率為1.67%［8］。隨著我國(guó)人口老齡化的到來(lái)，PD發(fā)病率逐年遞增，加之該病起病緩慢，病程較長(zhǎng)，晚期常出現(xiàn)肢體僵硬，同時(shí)伴高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如癡呆、抑郁等，甚至喪失生活自理能力，嚴(yán)重影響患者身心健康，給社會(huì)和患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。根據(jù)PD發(fā)病機(jī)制，延緩黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性和補(bǔ)充多巴胺是治療PD的基本原則，基于此，目前，左旋多巴仍然是治療PD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其可通過(guò)血腦屏障，在多巴胺脫羧酶作用下變?yōu)槎喟桶罚l(fā)揮替代療法的作用。在疾病初期具有明顯緩解作用，但長(zhǎng)期服用易出現(xiàn)直立性低血壓、心律失常，且易出現(xiàn)譫妄、幻覺(jué)等精神癥狀，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)異動(dòng)癥、劑末惡化現(xiàn)象、“開(kāi)-關(guān)”現(xiàn)象等并發(fā)癥［9］。顱內(nèi)手術(shù)，如蒼白球切開(kāi)術(shù)及下丘腦電刺激能減輕一些PD癥狀，神經(jīng)干細(xì)胞移植可通過(guò)細(xì)胞增殖、分化與整合替代多巴胺神經(jīng)元［10-12］。然而上述治療方法無(wú)一能改變黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)變性的進(jìn)程，因而加強(qiáng)PD的病因?qū)W研究、發(fā)現(xiàn)研制PD治療新藥的有效靶標(biāo)對(duì)提高人類(lèi)健康水平具有重大意義。

雷帕霉素通過(guò)抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路調(diào)節(jié)機(jī)體自噬、新陳代謝等。有研究表明，雷帕霉素通過(guò)有效抑制白介素-2對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的激活，使細(xì)胞停滯在G1期，有效減輕炎性反應(yīng)［13］。哺乳動(dòng)物mTOR通路廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要功能是依據(jù)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化，且對(duì)細(xì)胞自噬、新陳代謝及核糖體形成等均具有調(diào)控作用［14-16］。因此，雷帕霉素可通過(guò)多種途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近來(lái)年有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能延長(zhǎng)小鼠壽命，且阿爾茲海默病動(dòng)物模型的研究結(jié)果表明，雷帕霉素能改善阿爾茲海默病小鼠的認(rèn)知，減少淀粉蛋白的聚集，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［1-5］。本研究對(duì)雷帕霉素在PD中的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，注射雷帕霉素后能明顯改善注射MPTP導(dǎo)致的小鼠立毛、震顫等表現(xiàn)，同時(shí)通過(guò)行為學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能延長(zhǎng)PD小鼠懸掛時(shí)間，縮短PD小鼠爬桿時(shí)間，說(shuō)明雷帕霉素能明顯改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)行為障礙（圖1）。

多巴胺神經(jīng)元凋亡是PD主要的發(fā)病機(jī)制，Malagelada等［17］提出，雷帕霉素可通過(guò)下游真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1及絲氨酸/蘇氨酸激酶通路抑制低氧誘導(dǎo)因子1反應(yīng)基因蛋白的翻譯，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)蛋白激酶B第308位點(diǎn)上的蘇氨酸殘基磷酸化，減少神經(jīng)元凋亡。本研究通過(guò)采用免疫組化檢測(cè)小鼠腦組織酪氨酸羥化酶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能提高中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶的表達(dá)，從而對(duì)多巴胺神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。作者推測(cè)，雷帕霉素可能通過(guò)mTOR通路，促進(jìn)與細(xì)胞生存密切相關(guān)的蛋白激酶B通路的激活，進(jìn)而對(duì)多巴胺神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)（圖2）。

PD的主要病理改變是α-突觸核蛋白的聚集，本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能明顯降低中腦黑質(zhì)突觸核蛋白的聚集（圖3）。有研究表明，雷帕霉素通過(guò)直接抑制其下游信號(hào)通路mTORC1的功能，促進(jìn)細(xì)胞自噬功能，減輕氧自由基的損傷［18-19］。作者推測(cè)，雷帕霉素在PD中可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬功能，加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)突觸核蛋白的清除，從而減輕突觸核蛋白對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。關(guān)于雷帕霉素對(duì)PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素明顯改善了PD小鼠運(yùn)動(dòng)行為缺陷，提高了PD小鼠酪氨酸羥化酶的表達(dá)，降低了PD小鼠α-突觸核蛋白的表達(dá)，表明雷帕霉素對(duì)PD小鼠具有明顯神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，可能成為治療PD的一種新型藥物。

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Research on neuroprotective effects of rapamycin in Parkinson′s disease mice*

Qu Qi1#，He Xiaoliang2#，Zhang Yunlong2，Wang Kun1△，Zhang Xiuping3△（1.Guangzhou Municipal No.6 Middle School，Guangzhou，Guangdong 510300，China；2.Teaching and Researching Section of Immunology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China；3.Teaching Center of Experimental Teaching Management，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China）

ObjectiveTo study the neuroprotective effects of rapamycin in Parkinson′s disease（PD）mice.MethodsThe suspension test and the pole-climbing test were adopted to detect the improvement effect of rapamycin on the movement disorder of PD mice.The expression of tyrosine hydroxylase and α-synuclein in the substantia nigra of PD mice were examined via immunohistochemistry.ResultsRapamycin significantly improved the movement disorder of PD mice，increased the expression of tyrosine hydroxylase and decreased the expression of α-synuclein in the PD mice.ConclusionRapamycin has the obvious neuroprotective effects in PD mice.

Parkinson disease；Dopamine；Neurons；Synapsins；Sirolimus

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.001

A

1009-5519（2016）06-0801-03

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021800305）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014J4100008）。

瞿奇（1997-），在讀高中生，主要從事帕金森動(dòng)物模型制備及動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究；何小亮（1987-），在讀碩士研究生，主要從事免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

#共同第一作者。

△張秀萍，E-mail：spz9528@163.com；王坤，E-mail：281146423@qq.com。

（2016-01-26）