熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌研究

2016-09-03 09:35:03魏昭梁勃吳蕊孫琛王權衡水市食品藥品檢驗檢測中心

食品安全導刊 2016年14期

□ 魏昭梁勃吳蕊孫琛王權衡水市食品藥品檢驗檢測中心

熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌研究

□ 魏昭梁勃吳蕊孫琛王權衡水市食品藥品檢驗檢測中心

實時熒光定量PCR技術（FQ-PCR）實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，可對目標DNA分子起始拷貝數(shù)精確定量。因其檢測方法精確、靈敏、污染途徑少，已成為國際公認的核酸分子定量的標準方法，在食品中安全微生物的鑒定也有重要應用［1］。沙門氏菌是引起食物中毒最為常見的致病菌，因此，建立食品中沙門氏菌中熒光定量PCR檢測方法有重要的研究意義。材料與方法 1菌株：鼠傷寒沙門氏菌（C77-31）有中科院微生物所提供，肉類、奶制品等產品均購于農產品市場。2主要試劑和設備：DNA提取試劑購買于美國Invitrogen公司；Taq酶和緩沖液購買于日本TaKara；opction2熒光定量PCR購買于美國MJ公司；超速離心機購買于Eppendorf；細菌鑒定儀；所用的常規(guī)試劑均為分析純，購買于國藥化學試劑有限公司；方法，將標準菌株在XLD、三糖鐵斜面和肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從肉湯培養(yǎng)基中取一定量的菌液裝入EP管中，離心，去上清，加入雙蒸水，沸水浴、冰水浴，離心，取上清。食品樣品采用沙門氏菌國標檢測法（GB 4789.4-2010）中BPW前增菌之后的培養(yǎng)液裝入EP管中，進行相同的操作。引物探針設計，在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象，然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo驗證評估引物。經過篩選進行特異性和靈敏度的實驗。

表1　引物和探針序列

實時熒光PCR反應體系與反應條件

分別考察了不同Taq酶用量，Mg2+濃度、引物濃度和探針濃度對所提取的核酸進行擴增的影響。同時對循環(huán)條件也進行了優(yōu)化。靈敏度實驗，將沙門氏菌按照上述的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，測量OD后估算菌數(shù)，然后稀釋、涂板確定菌密度，然后用熒光定量PCR進行檢測。

特異性實驗，將沙門氏菌與其他的食品致病菌共同進行特異性實驗，做陽性對照實驗并用國標法進行驗證。

結果與分析

反應體系的優(yōu)化 1Taq酶的優(yōu)化，考察了不同的酶量（0.5至2.5U，每個梯度為0.5）對陽性模板的Ct值的影響，陽性模板Ct值為23.1-23.95之間變化，其影響并不大，當酶量為2.5U時，整個反應體系的熒光量最高。2Mg2+濃度的有優(yōu)化，從表2中可以看出，不同的Mg2+濃度對陽性模板的Ct的影響并不大，當酶量為3.5U時，整個反應體系的熒光量最高，因此，后續(xù)實驗也選用該濃度作為最佳濃度。

表2　Mg2+濃度對陽性模板的Ct值的影響

3引物探針量的優(yōu)化，分別選擇了引物濃度0.25，0.5，0.75和1.0μmol/L，探針的濃度分別為0.125，0.5，0.75 和1.0μmol/L，并以不同的濃度的引物和探針濃度配比，對提取的核酸進行PCR擴增。研究結果表明當引物濃度為0.75μmol/L，探針濃度為0.5μmol/L時熒光效率最高，因此，該濃度作為最佳條件。4循環(huán)條件的優(yōu)化，在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。退火是PCR的一個關鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃，延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度［3］。從表4中可以看出延伸時溫度為60℃較好。

表3　循環(huán)條件的優(yōu)化

特異性檢測

對50份食品分別按照熒光定量PCR、國標法對沙門氏菌進行檢測，熒光定量PCR的陽性數(shù)為9，國標法為8，其陽性率分別為18%和16%。雖然兩種方法的差異并不顯著，但是熒光定量PCR檢出數(shù)相對偏高，檢測時間上大大降低。這是由于熒光定量PCR使用特異性探針對定量分子進行識別，具有很高的準確性。同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。靈敏度檢測，熒光PCR檢測技術是綜合了PCR技術、熒光標記技術、激光技術、數(shù)碼顯象技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。按Ct值不大于35.0判斷為陽性，建立的方法檢測靈敏度可達100CFU/ml。