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        熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌研究

        2016-09-03 09:35:03魏昭梁勃吳蕊孫琛王權(quán)衡水市食品藥品檢驗檢測中心
        食品安全導(dǎo)刊 2016年14期
        關(guān)鍵詞:沙門氏菌探針定量

        □ 魏昭 梁勃 吳蕊 孫琛 王權(quán) 衡水市食品藥品檢驗檢測中心

        熒光定量PCR檢測食品中沙門氏菌研究

        □ 魏昭 梁勃 吳蕊 孫琛 王權(quán) 衡水市食品藥品檢驗檢測中心

        實時熒光定量PCR技術(shù)(FQ-PCR)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,可對目標(biāo)DNA分子起始拷貝數(shù)精確定量。因其檢測方法精確、靈敏、污染途徑少,已成為國際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法,在食品中安全微生物的鑒定也有重要應(yīng)用[1]。沙門氏菌是引起食物中毒最為常見的致病菌,因此,建立食品中沙門氏菌中熒光定量PCR檢測方法有重要的研究意義。材料與方法 1菌株:鼠傷寒沙門氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供,肉類、奶制品等產(chǎn)品均購于農(nóng)產(chǎn)品市場。2主要試劑和設(shè)備:DNA提取試劑購買于美國Invitrogen公司;Taq酶和緩沖液購買于日本TaKara;opction2熒光定量PCR購買于美國MJ公司;超速離心機(jī)購買于Eppendorf;細(xì)菌鑒定儀;所用的常規(guī)試劑均為分析純,購買于國藥化學(xué)試劑有限公司;方法,將標(biāo)準(zhǔn)菌株在XLD、三糖鐵斜面和肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng),從肉湯培養(yǎng)基中取一定量的菌液裝入EP管中,離心,去上清,加入雙蒸水,沸水浴、冰水浴,離心,取上清。食品樣品采用沙門氏菌國標(biāo)檢測法(GB 4789.4-2010)中BPW前增菌之后的培養(yǎng)液裝入EP管中,進(jìn)行相同的操作。引物探針設(shè)計,在NCBI上搜索到目的基因,找到該基因的mRNA,在CDS選項中,找到編碼區(qū)所在位置,在下面的origin中,Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象,然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo驗證評估引物。經(jīng)過篩選進(jìn)行特異性和靈敏度的實驗。

        表1 引物和探針序列

        實時熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

        分別考察了不同Taq酶用量,Mg2+濃度、引物濃度和探針濃度對所提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的影響。同時對循環(huán)條件也進(jìn)行了優(yōu)化。靈敏度實驗,將沙門氏菌按照上述的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng),測量OD后估算菌數(shù),然后稀釋、涂板確定菌密度,然后用熒光定量PCR進(jìn)行檢測。

        特異性實驗,將沙門氏菌與其他的食品致病菌共同進(jìn)行特異性實驗,做陽性對照實驗并用國標(biāo)法進(jìn)行驗證。

        結(jié)果與分析

        反應(yīng)體系的優(yōu)化 1Taq酶的優(yōu)化,考察了不同的酶量(0.5至2.5U,每個梯度為0.5)對陽性模板的Ct值的影響,陽性模板Ct值為23.1-23.95之間變化,其影響并不大,當(dāng)酶量為2.5U時,整個反應(yīng)體系的熒光量最高。2Mg2+濃度的有優(yōu)化,從表2中可以看出,不同的Mg2+濃度對陽性模板的Ct的影響并不大,當(dāng)酶量為3.5U時,整個反應(yīng)體系的熒光量最高,因此,后續(xù)實驗也選用該濃度作為最佳濃度。

        表2 Mg2+濃度對陽性模板的Ct值的影響

        3引物探針量的優(yōu)化,分別選擇了引物濃度0.25,0.5,0.75和1.0μmol/L,探針的濃度分別為0.125,0.5,0.75 和1.0μmol/L,并以不同的濃度的引物和探針濃度配比,對提取的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。研究結(jié)果表明當(dāng)引物濃度為0.75μmol/L,探針濃度為0.5μmol/L時熒光效率最高,因此,該濃度作為最佳條件。4循環(huán)條件的優(yōu)化,在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈。退火是PCR的一個關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結(jié)合。實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃,延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度[3]。從表4中可以看出延伸時溫度為60℃較好。

        表3 循環(huán)條件的優(yōu)化

        特異性檢測

        對50份食品分別按照熒光定量PCR、國標(biāo)法對沙門氏菌進(jìn)行檢測,熒光定量PCR的陽性數(shù)為9,國標(biāo)法為8,其陽性率分別為18%和16%。雖然兩種方法的差異并不顯著,但是熒光定量PCR檢出數(shù)相對偏高,檢測時間上大大降低。這是由于熒光定量PCR使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別,具有很高的準(zhǔn)確性。同時,靶序列由引物和探針雙重控制,特異性好、假陽性低。靈敏度檢測,熒光PCR檢測技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù),因此它的檢測靈敏度很高。按Ct值不大于35.0判斷為陽性,建立的方法檢測靈敏度可達(dá)100CFU/ml。

        表4 各濃度熒光定量PCR的檢測結(jié)果

        通過對熒光定量PCR的反應(yīng)條件和循環(huán)體系條件進(jìn)行優(yōu)化,本研究建立的熒光定量PCR檢測方法特異性和靈敏度都較高,克服了普通PCR的缺點,為食品中致病微生物的定量研究提供了理論和實踐的借鑒意義。

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