李友山　楊博華　冀凌云

中藥"蚓黃散"對大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面形態(tài)及促愈因子的影響

李友山楊博華冀凌云

目的 應(yīng)用中藥"蚓黃散"外治糖尿病足潰瘍,觀察其對創(chuàng)面組織愈合過程中的促進作用,探討大鼠糖尿病潰瘍愈合的作用機制.方法 建立大鼠糖尿病足潰瘍模型后設(shè)模型組、西藥組、中藥組各10只,另設(shè)空白組10只,空白組及模型組創(chuàng)面不予干預(yù),西藥組予甲硝唑注射液外敷,中藥組予"蚓黃散"外敷,治療10天后檢測大鼠血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycasylation end products,AGEs)、炎性因子及生長因子含量;增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、CD34染色分別檢測創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細胞數(shù)、新生毛細血管數(shù);HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化.結(jié)果 與模型組比較,藥物干預(yù)后大鼠血清中AGEs和腫瘤壞死因子-a、白細胞介素-1、C-反應(yīng)蛋白均可降低,堿性成纖維因子、表皮細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子水平均有所提高,創(chuàng)面肉芽組織中新生毛細血管數(shù)、成纖維細胞數(shù)均增多(P<0.05),而中藥組均作用顯著(P<0.05).結(jié)論 "蚓黃散"可明顯促進大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合,其機制可能與改善大鼠的炎性狀態(tài),提高大鼠血清中生長因子含量,降低AGEs水平,促進新生毛細血管、成纖維細胞的增殖有關(guān).

蚓黃散; 創(chuàng)面愈合; 炎性因子; 生長因子; 晚期糖基化終末產(chǎn)物

糖尿病足的發(fā)病是一個多方面的、復(fù)雜的疾病,發(fā)病機制存在多種學(xué)說.近年來,糖尿病足的脂毒性和糖毒性成為研究重點,其中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycasylation end products,AGEs)在皮膚組織的大量蓄積導(dǎo)致組織細胞學(xué)行為的改變已經(jīng)成為關(guān)注熱點[1].研究表明,高血糖及AGEs的蓄積不僅造成微血管及外周血管的損傷,還可造成多種血管、神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達降低,這可能是糖尿病足潰瘍難以愈合的重要環(huán)節(jié)[2].糖尿病足潰瘍愈合是一個動態(tài)的病理、生理過程,在修復(fù)過程中分為炎癥期、肉芽組織形成期、瘢痕重塑期3個連續(xù)而又相互重疊的階段[3].糖尿病足潰瘍當屬中醫(yī)"脫疽""消渴"的范疇,中醫(yī)多認為該病的主要病機為:氣陰虧虛、瘀血阻絡(luò)、外感濕熱[4].筆者認為濕熱與毒瘀是糖尿病足潰瘍的主要致病因素,所以中醫(yī)外治重在清熱解毒利濕.中藥"蚓黃散"由黃柏、地龍、血竭共三味傳統(tǒng)中藥組成,以清熱解毒利濕為法,祛腐與生肌并重的治療原則,以達到促進創(chuàng)面愈合的目的,一定程度上降低了截肢率[5].

本實驗研究應(yīng)用"蚓黃散"干預(yù)糖尿病足潰瘍后,創(chuàng)面組織愈合過程中AGEs、炎性因子---腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、超敏C反應(yīng)蛋白(highsensitivity C-reactive protein,hs-CRP)及生長因子---堿性成纖維因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮細胞生長因子(endothelial growth factor,EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)的細胞生物學(xué)活性變化,進一步探討糖尿病足潰瘍愈合的相關(guān)機制與作用環(huán)節(jié).

1　材料與方法

1.1試劑與藥品

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)(購自sigmaaldrich,批號:20120728);檸檬酸、檸檬酸鈉(購自北京化學(xué)試劑廠,批號:051024);酶聯(lián)免疫試劑盒(購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司,批號:23064D433);免疫組化PCNA檢測試劑盒(ZM-0213)(購自北京中杉金橋生物制品有限公司,批號:13132A10);免疫組化CD34檢測試劑盒(ZM-0046)(購自北京中杉金橋生物制品有限公司,批號:12201110).

1.2實驗動物與飼料

SD大鼠,體質(zhì)量80～100 g,SPF級,雄性,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所.飼料(高脂高糖)配方:基礎(chǔ)飼料67.5%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃2.5%.

1.3STZ溶液制備

取檸檬酸A溶液和檸檬酸鈉B溶液,按照A:B=1:1.32,配制BX緩沖液,精確稱量STZ,按1%濃度溶于BX緩沖液中.(注意:STZ見光自然分解,需避光,并在冰浴中配制,要求15分鐘內(nèi)使用完畢).STZ注射劑量公式:(體重XSTZ預(yù)設(shè)給藥劑量)/1000=STZ用量(mg)

1.4藥物制備

"蚓黃散"由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備,黃柏30 g、地龍20 g、血竭10 g,共三味中藥各粉碎成細粉(過六號篩).對照藥選用甲硝唑葡萄糖注射液(購自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司,國藥準字1102161).

1.5實驗方法

1.5.1糖尿病潰瘍大鼠模型制備 大鼠用高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個月,腹腔注射STZ 40 mg/kg制備糖尿病大鼠模型.成模后用龍膽紫在大鼠背部脫毛區(qū)標記造模面積,在無菌條件下,將造模區(qū)皮膚剪去,深達筋膜.六層醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面,用醫(yī)用紙膠帶包扎固定.見圖1.

1.5.2給藥方法 將糖尿病潰瘍成模后大鼠隨機分為3組,模型對照組(簡稱:模型組)10只、西藥組10只、中藥組10只;普通SD大鼠10只設(shè)為空白組.空白組、模型對照組大鼠創(chuàng)面不予處理,西藥組創(chuàng)面外敷甲硝唑葡萄糖注射液小紗布(4 cmX4 cm),予醫(yī)用紙膠帶包扎固定,每天1次;中藥組創(chuàng)面外敷"蚓黃散",六層醫(yī)用小紗布覆蓋創(chuàng)面(4 cmX4 cm),予醫(yī)用紙膠帶包扎固定,每天1次,觀察10天.見圖2.

圖1　糖尿病潰瘍大鼠模型制備

1.5.3血清的采集和檢測 取大鼠腹主動脈血液,采用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血清中TNF-a、IL-1、hs-CRP、EGF、bFGF、VEGF、PDGF、AGEs的含量.

1.5.4肉芽組織的采集及HE染色 創(chuàng)面中心點取肉芽組織(5 g左右),用4%中性多聚甲醛灌注固定,清水沖洗,浸泡,脫水,透明,浸蠟,用石蠟包埋,切片(切片厚5 μm).HE染色后,圍繞皮膚結(jié)構(gòu)和功能的微小單位(再生結(jié)構(gòu)單位),進行觀察比較.采用多功能顯熒光顯微鏡(BX60,日本OLYMPUS公司)觀察組織創(chuàng)面和周圍組織的病理形態(tài).

1.5.5肉芽組織成纖維細胞數(shù)、毛細血管表達檢測(PCNA、CD34染色法) 大鼠創(chuàng)面肉芽組織石蠟切片采用PCNA、CD34免疫組織化學(xué)染色SP方法:包括防脫處理、脫蠟、滅活內(nèi)源性酶、熱修復(fù)抗原、滴加PCNA(CD34)單克隆抗體,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察.

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計處理.實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,多組之間的兩兩比較采用LSD法;不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗.以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1炎性因子及生長因子變化

與空白組比較,模型組大鼠血清中炎性因子顯著升高,生長因子顯著下降,AGEs顯著升高,差異顯著(P<0.01).與模型組比較,西藥組和中藥組大鼠血清中炎性因子顯著下降,生長因子顯著升高, AGEs顯著下降,差異顯著(P<0.01).與西藥組比較,中藥組大鼠血清中TNF-a、IL-1下降,差異顯著(P<0.01),生長因子顯著升高,AGEs顯著下降.見表1.

2.2大鼠肉芽組織石蠟切片HE染色光鏡觀察結(jié)果

空白組可見較少的炎性細胞,大量成纖維細胞,細胞較大,胞漿較多,核仁著色明顯.模型組可見較多的中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞,成纖維細胞數(shù)量很少,少許新生毛細血管.中藥組可見少量的炎性細胞,成纖維細胞數(shù)量較多,細胞較大,胞漿較多,核仁著色明顯.西藥組可見少量的炎性細胞,但較中藥組較多,成纖維細胞數(shù)量較中藥組少,細胞胞體外形較小,胞漿突起不明顯.見圖3.

2.3免疫組化

與空白組比較,模型組大鼠新生毛細血管數(shù)密度及成纖維細胞數(shù)顯著降低(P<0.05).與模型組比較,西藥組和中藥組的新生毛細血管數(shù)密度及成纖維細胞數(shù)顯著升高(P<0.05).與西藥組比較,中藥組新生毛細血管數(shù)密度及成纖維細胞數(shù)顯著升高(P<0.05).見表2.

圖2　空白對照組與實驗組創(chuàng)面情況

表1　各組大鼠炎性因子及生長因子檢測結(jié)果

圖3　各組大鼠肉芽組織石蠟切片HE染色(X40)

表2　各組大鼠毛細血管數(shù)密度及成纖維細胞數(shù)檢測結(jié)果

3　討論

3.1炎性因子對糖尿病潰瘍后創(chuàng)面愈合的影響

hs-CRP是一種非特異性的炎癥標志物,由內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和脂肪細胞衍生的促炎癥細胞因子(IL-1、TNF-a等)誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生[6].本病為慢性創(chuàng)面,hs-CRP持續(xù)較高水平將成為創(chuàng)面缺血的因素之一,不利于創(chuàng)面愈合.因此,降低hs-CRP的含量,將有效地控制炎癥的發(fā)生,也減少了創(chuàng)面缺血的發(fā)生幾率.TNF-a主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生,也可由一些炎性細胞分泌,具有多種生物效應(yīng),既可增強中性粒細胞的吞噬能力,又抑制腫瘤細胞的產(chǎn)生,作用于肝臟,使hs-CRP產(chǎn)生增多[7].IL-1參與各種炎癥現(xiàn)象及新陳代謝和細胞修復(fù).另外,IL-1作為內(nèi)分泌激素,可以激發(fā)全身的炎癥反應(yīng),使機體表現(xiàn)為應(yīng)激狀態(tài),對免疫系統(tǒng)內(nèi)細胞有調(diào)節(jié)作用[8],與創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān).局部炎癥反應(yīng)對組織造成有一定的損害,降低hs-CRP、IL-1、TNF-a等炎癥介質(zhì)的過度合成和釋放,有利于控制炎癥反應(yīng)程度,進而有利于創(chuàng)面的愈合.

本實驗的結(jié)果可以看出經(jīng)藥物干預(yù)后大鼠血清中hs-CRP和TNF-a、IL-1均可降低,而中藥治療組降低TNF-a、IL-1作用顯著,考慮蚓黃散能較好地改善大鼠的炎癥狀態(tài),這可能與促進創(chuàng)面的愈合有關(guān).

3.2生長因子對糖尿病潰瘍后創(chuàng)面愈合的影響

既往研究表明糖尿病足局部組織bFGF的表達并不減少,但大量被糖基化,失去了應(yīng)有的生物學(xué)活性,因此在bFGF蛋白被大量糖基化的情況下,加之新生的bFGF不足,可能是糖尿病足潰瘍創(chuàng)面難以愈合的重要原因之一[9-10].EGF是一類對多類細胞生長有促進或抑制作用的多肽.體內(nèi)EGF受體與EGF結(jié)合后,形成受體EGF復(fù)合物,通過一系列生化反應(yīng)調(diào)控細胞增殖的一系列重要基因,啟動創(chuàng)面修復(fù)的過程,并對上皮細胞有強烈的促生長作用[11].VEGF有利于毛細血管融合成較大血管,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖與遷移、促進新生毛細血管的形成[12].在創(chuàng)傷愈合過程中,VEGF協(xié)同F(xiàn)GF刺激內(nèi)皮細胞生長,促進創(chuàng)面血管化的進程[13]. PDGF是一種由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等釋放,儲存于血小板a顆粒中的血清生長因子.PDGF可作用于組織修復(fù)細胞,加速細胞增殖,促進傷口愈合[14].在創(chuàng)面修復(fù)不同過程中,各種生長因子分別起到趨化作用、合成分泌作用、增殖分化作用、誘導(dǎo)凋亡、刺激血管新生等多種生物效應(yīng),從而促進創(chuàng)面愈合.當創(chuàng)面內(nèi)源性生長因子種類、含量平衡失調(diào)或其受體活性下降時,可導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)困難.

本實驗研究的結(jié)果可以看出經(jīng)藥物干預(yù)后大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF、PDGF水平均可以提高,而蚓黃散可以顯著地提高大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF、PDGF水平,促進糖尿病潰瘍的愈合.

3.3AGEs對糖尿病潰瘍后創(chuàng)面愈合的影響

AGEs是正常體內(nèi)氨基酸和還原糖生成的阿馬多里(Amadori)產(chǎn)物經(jīng)過一系列脫水、氧化及化學(xué)重排,產(chǎn)生高度活性的羰基化合物,進而與蛋白質(zhì)的自由氨基起反應(yīng)而凝聚成的不可逆的終末產(chǎn)物[16].持續(xù)高糖狀態(tài)下,糖的醛基與蛋白質(zhì)的氨基可生成AGEs,生長因子糖基化時,其功能活性降低,從而影響修復(fù)細胞的增殖和遷移;糖基化過程中,可引起蛋白質(zhì)的斷裂;神經(jīng)鞘磷脂的糖基化可使吞噬細胞分泌蛋白酶,進而引起神經(jīng)脫髓鞘病變[15].因此,AGEs的蓄積及高糖狀態(tài),可以引起微血管、外周血管損傷,神經(jīng)營養(yǎng)因子表達下降[2].

本實驗的結(jié)果可以看出藥物干預(yù)均可以降低大鼠血清中AGEs的含量,而蚓黃散在降低大鼠血清中AGEs水平方面作用顯著.

3.4血管新生與成纖維細胞

在創(chuàng)面愈合過程中,肉芽組織的形成至關(guān)重要,其可直接影響創(chuàng)面愈合的過程及其預(yù)后.肉芽組織的本質(zhì)是豐富的成纖維細胞和大量的新生毛細血管.豐富的新生毛細血管,改善了創(chuàng)面微循環(huán),加速了創(chuàng)面的新陳代謝,為組織的修復(fù)提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和必須的氧,促進了創(chuàng)面的愈合[17-18].成纖維細胞在皮膚損傷后,創(chuàng)緣真皮成纖維細胞被激活發(fā)生轉(zhuǎn)化,胞質(zhì)出現(xiàn)具有收縮能力的張力纖維,促進創(chuàng)面愈合.

本實驗結(jié)果表明,甲硝唑葡萄糖注射液與蚓黃散均有促進新生毛細血管生長、增殖的作用,其中蚓黃散在改善新生肉芽組織中數(shù)密度效果最顯著.而在成纖維細胞方面,甲硝唑葡萄糖注射液與蚓黃散均可升高成纖維細胞數(shù),其中蚓黃散在升高成纖維細胞數(shù)效果最顯著.筆者推測蚓黃散可能是有利于成纖維細胞、新生毛細血管的增殖、創(chuàng)面肉芽組織的生長,從而促進了創(chuàng)面的愈合.

實驗表明:在糖尿病足潰瘍愈合過程中,炎性因子及生長因子起到了至關(guān)重要的作用,中藥"蚓黃散"外用干預(yù)糖尿病足潰瘍可使炎性因子減少和生長因子增加,從而加快糖尿病足潰瘍的愈合.

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(本文編輯:韓虹娟)

Effect of Yinhuangsan on morphology of ulcer wound and ulcer healing factors on diabetic rats

LIYou-shan,YANG Bo-hua,JI Ling-yun. Department of peripheral vascular,Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China
Corresponding Author:LI You-shan,E-mail:lys4626@sina.com

Objective To study the role of traditional Chinese medicines(TCM)"Yinhuangsan" in the external treatment of diabetic foot ulcers by observing the process of the wound tissue healing and exploring the mechanism of the rat diabetic ulcer healing.Methods Diabetic foot ulcer model was established and the rats were randomly divided into model group,western medicine group and TCM group,10 rats in each group,rats in all groups were respectively by gavage given oral no drug,metronidazole and Yinhuangsan.Another 10 normal rats were set as control group without drug treatment.After 10 days of treatment,the contents of AGEs,inflammatory factor and growth factor in serum were detected.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)staining and CD34 staining were respectively used to detect the number of fibroblast and number of newly born capillaries in granulation tissue.Hematoxylin and eosin(HE)staining was used to observe morphological changes.Results Compared with the model group,the content of AGEs, tissue necrosis factor-a(TNF-a),interleukin-1(IL-1)and C-reactive protein(CRP)were reduced after drug intervention,basic fibroblast growth factor(bFGF),endothelial growth factor(EGF),vascular endothelial growth factor(VEGF)and platelet derived growth factor(PDGF)were increased after drug intervention,newly born capillaries and fibroblasts were increased in granulation tissue(P<0.05),and the effect of TCM group was more pronounced than western medicine group(P<0.05).Conclusions Yinhuangsan cansignificantly promote the healing of ulcer wound in diabetes rats.The mechanism may be related to reducing inflammatory factor and AGEs in rat serum while improving growth factor,in rat serum,and promoting newly born capillaries and fibroblasts proliferation in the granulation tissue.

Yinhuangsan; Wound healing; Inflammatory factor; Growth factor; Advanced glycasylation end products

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.003

國家自然科學(xué)基金(81302980)

100700北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院周圍血管科

李友山(1979-),博士,副主任醫(yī)師.研究方向:中醫(yī)外科周圍血管病研究.E-mail:lys4626@ sina.com

2015-03-21)