姜　洋　楊惠民　馬玉琪　梁志齊

補(bǔ)腎祛瘀化痰法對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠Morris水迷宮研究的影響

姜洋楊惠民馬玉琪梁志齊

目的 通過研究補(bǔ)腎祛瘀化痰法對(duì)ApoE基因敲除小鼠Morris水迷宮成績(jī)的影響,探討補(bǔ)腎祛瘀化痰法對(duì)認(rèn)知功能障礙的改善作用.方法 將ApoE基因敲除小鼠共32只隨機(jī)分為成年中藥組、成年模型組及老年中藥組、老年模型組,并取相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠共16只隨機(jī)分成成年正常組及老年正常組,連續(xù)給予補(bǔ)腎祛瘀化痰法組方灌胃12周,成年組至32周齡、老年組至44周齡時(shí)檢測(cè)Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)的成績(jī).結(jié)果 定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期結(jié)果不符合正態(tài)分布,故采用非參數(shù)檢驗(yàn)中K組獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):成年各組之間逃避潛伏期無明顯差異(P>0.05).老年模型組較老年中藥組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01),老年模型組較老年正常組亦明顯延長(zhǎng)(P<0.05).空間探索實(shí)驗(yàn)中,第Ⅲ象限路程及第Ⅲ象限時(shí)間均符合正態(tài)分布,故采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):成年各組之間在穿臺(tái)次數(shù)、第Ⅲ象限路程及第Ⅲ象限時(shí)間均無明顯差異(P>0.05);老年模型組較老年正常組穿臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05),老年中藥組及老年模型組均較老年正常組在第Ⅲ象限路程及第Ⅲ象限時(shí)間明顯縮短(P<0.05).結(jié)論老年中藥組及老年正常組小鼠Morris水迷宮成績(jī)較理想,說明補(bǔ)腎祛瘀化痰法可改善老齡小鼠Morris水迷宮成績(jī),從而改善認(rèn)知功能.

補(bǔ)腎祛瘀化痰法; ApoE基因敲除小鼠; Morris水迷宮

ApoE基因敲除小鼠由于缺乏ApoE基因而容易出現(xiàn)脂質(zhì)代謝障礙,可導(dǎo)致血脂異常及脂質(zhì)堆積引起的血管內(nèi)皮炎性損傷,故ApoE基因敲除小鼠更易受到氧化應(yīng)激作用的侵害而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化等.本實(shí)驗(yàn)中以補(bǔ)腎祛瘀化痰中藥干預(yù)ApoE基因敲除小鼠,并觀察各組在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力,從而探索補(bǔ)腎祛瘀化痰法對(duì)小鼠認(rèn)知功能的改善作用.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)8周齡ApoE基因敲除小鼠32只,均為雄性,體質(zhì)量(20±2)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(京)2011-0012;8周齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠16只,均為雄性,體質(zhì)量(20±2)g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(軍)2007-004.飼養(yǎng)場(chǎng)地為北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房,普通飲食,充足攝食及飲水,室溫(25±2)℃,每天光照12小時(shí),濕度50%～70%.

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 通脈益智膠囊的藥物組成:女貞子15 g、何首烏20 g、丹參30 g、赤芍15 g、石菖蒲20 g、遠(yuǎn)志10 g、漏蘆10 g.將上述藥物水煎煮后濃縮干燥,粉碎過篩,混勻制成膠囊,購自中日友好醫(yī)院試劑科,批號(hào):Z20053786.

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮系統(tǒng),包括水迷宮、電腦攝像系統(tǒng)、配套軟件分析系統(tǒng),上海移碼數(shù)字有限公司生產(chǎn),由北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥方法 將32只ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為四組,即成年中藥組、老年中藥組、成年模型組及老年模型組,每組8只;將16只同品系C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組,即成年正常組及老年正常組,每組8只.成年組小鼠至20周起、老年組小鼠至32周起,中藥組以通脈益智膠囊750 mg/(kg.d)灌胃12周(本劑量根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算得出),模型組與正常組以同容積0.9%氯化鈉注射液灌胃12周,均每天1次.

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 成年組小鼠到32周齡時(shí)、老年組小鼠到44周齡時(shí),予Morris水迷宮實(shí)驗(yàn).Morris水迷宮測(cè)試程序主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分.定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5天,其中訓(xùn)練2天,正式測(cè)試3天,檢測(cè)小鼠的逃避潛伏期,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以正式測(cè)試為準(zhǔn).空間探索實(shí)驗(yàn)歷時(shí)1天,在定位航行實(shí)驗(yàn)后正式測(cè)試后進(jìn)行.根據(jù)池壁上懸掛的四個(gè)入水點(diǎn),將水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)象限,第Ⅲ象限處存在隱匿平臺(tái).定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期間,小鼠每天分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限入水點(diǎn)處入水2次(每天共入水6次),由圖像采集及處理系統(tǒng)記錄小鼠航行軌跡、找到隱匿平臺(tái)時(shí)間(即:逃避潛伏期)等,若小鼠60秒內(nèi)未找到隱匿平臺(tái),則逃避潛伏期按60秒計(jì)算,并由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)小鼠至平臺(tái).待小鼠在平臺(tái)上休息10秒后撈出,將下只小鼠放入水池.定位航行實(shí)驗(yàn)正式測(cè)試時(shí),亦按照訓(xùn)練期間方式進(jìn)行測(cè)試,并采集各項(xiàng)數(shù)據(jù);于正式測(cè)試結(jié)束后第二日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),小鼠入水步驟不變,將位于第Ⅲ象限隱匿平臺(tái)撤掉,記錄其在第Ⅲ象限航行的路程及時(shí)間,來考察小鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶.

恒溫游泳池直徑120 cm,水深30 cm,隱匿平臺(tái)低于水面1～2 cm,水溫保持在(23±1)℃.為與黑色ApoE基因敲除小鼠形成鮮明對(duì)比,故在池水中加入適量奶粉,使池水呈現(xiàn)乳白色.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理.其中各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)、第Ⅲ象限航行的路程及時(shí)間為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組之間比較若符合正態(tài)分布且方差齊則采用單因素方差分析,兩組之間比較采用LSD及S-N-K統(tǒng)計(jì)方法;若符合正態(tài)分布而方差不齊則采用Tamhane's T2及Dunnett's T3檢驗(yàn);若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn);穿臺(tái)次數(shù)為計(jì)數(shù)資料,使用卡方檢驗(yàn);以P<0.01表示有顯著差異的界限.

2　結(jié)果

2.1定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)

先檢測(cè)每組小鼠每天定位航行時(shí)間,再匯總?cè)鞙y(cè)試結(jié)果(第三、四、五天),統(tǒng)計(jì)各組小鼠之間的定位航行時(shí)間差異,結(jié)果顯示,與老年模型組相比,老年中藥組定位航行時(shí)間更短,具有顯著差異(P<0.01),老年正常組航行時(shí)間亦較短,具有明顯差異(P<0.05).見表1、2,圖1A、B.

表1　各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)(±s,n=8,s)

表1　各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)(±s,n=8,s)

訓(xùn)練測(cè)試組別第三天第四天第五天成年中藥組53.68±12.645.04±16.543.79±16.3944.23±16第一天第二天.641.4±19.27成年模型組44.67±16.9743.81±14.0141.68±17.639.26±18.5538.68±15.92成年正常組48.6±17.6148.94±15.5241.57±18.1340.98±20.0447.79±16.91老年中藥組50.17±14.7836.87±14.2428.90±14.5734.76±18.5126.76±18.01老年模型組50.64±16.5646.26±15.8344.93±18.8337.46±20.8638.65±21.05老年正常組48.61±18.0838.79±19.8539.98±19.6934.35±16.727.51±16.06

表2　各組小鼠定位航行測(cè)試匯總結(jié)果(±s,n=8,s)

表2　各組小鼠定位航行測(cè)試匯總結(jié)果(±s,n=8,s)

注:與老年模型組相比,aP<0.01、bP<0.05.

組別測(cè)試匯總組別測(cè)試匯總組別測(cè)試匯總成年中藥組43.14±17.37成年模型組39.87±17.28成年正常組43.45±18.49老年中藥組30.14±17.29a老年模型組40.35±20.35老年正常組33.95±18.13b

圖1　各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)

第1天各組小鼠的定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)無明顯差異(P>0.05),隨著訓(xùn)練時(shí)間的增長(zhǎng),小鼠逃避潛伏期呈遞減趨勢(shì).將第三天至第五天匯總后得出逃避潛伏期的成績(jī)(即測(cè)試成績(jī))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得出:成年各組之間,模型組較正常組及中藥組逃避潛伏期雖有所縮短,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);老年各組則可見明顯差異,與老年模型組相比,老年中藥組逃避潛伏期明顯縮短,具有顯著差異(P<0.01),老年正常組亦具有明顯差異(P<0.05),而老年中藥組與老年組之間無明顯差異(P>0.05).

2.2空間探索實(shí)驗(yàn)

小鼠入水步驟不變,將位于第Ⅲ象限隱匿平臺(tái)撤掉,記錄其在第Ⅲ象限航行的路程及時(shí)間.穿臺(tái)次數(shù)的結(jié)果顯示:老年模型組較老年正常組有明顯差異(P<0.05),而成年各組之間無明顯差異(P>0.05).第Ⅲ象限路程:老年中藥組及老年模型組較正常組均有顯著差異(P<0.01).成年各組之間無明顯差異(P>0.05).第Ⅲ象限時(shí)間:老年中藥組及老年模型組較正常組均有明顯差異(P<0.05),成年各組之間無明顯差異(P>0.05).見表3.

表3　各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)成績(jī)(±s,n=8)

表3　各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)成績(jī)(±s,n=8)

注:與老年正常組相比,aP<0.01,bP<0.05.

組別穿臺(tái)次數(shù)第Ⅲ象限路程(cm)第Ⅲ象限時(shí)間(s)成年中藥組2.39±1.46445.9±119.3520.12±4.23 0.95±1.28175.19±124.3714.22±9.71成年模型組1.00±1.03215.12±74.5518.14±6.93成年正常組0.83±0.79197.07±70.7115.36±7.24老年中藥組1.78±1.44337.17±170.42a16.42±9.14b老年模型組1.50±1.88b348.0±306.99a16.40±13.33b老年正常組

空間探索實(shí)驗(yàn)以穿越撤走平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)所在第Ⅲ象限的游泳路程及時(shí)間計(jì)算.空間探索實(shí)驗(yàn)成績(jī)中,成年各組在穿臺(tái)次數(shù)、第Ⅲ象限游泳路程及第Ⅲ象限停留時(shí)間均無明顯差異(P>0.05).而老年各組中,老年正常組在第Ⅲ象限游泳路程顯著超越中藥組及模型組(P<0.01),老年正常組在第Ⅲ象限時(shí)間明顯超越中藥組及模型組(P<0.01),穿臺(tái)次數(shù)亦較模型組有明顯差異(P<0.05).

3　討論

本實(shí)驗(yàn)中采用的Morris水迷宮是一種強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳,學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺(tái)的一種實(shí)驗(yàn),主要用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力.由于本實(shí)驗(yàn)ApoE基因敲除小鼠均飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房,在飼養(yǎng)周期無法將小鼠移出實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),故水迷宮實(shí)驗(yàn)僅在飼養(yǎng)周期完成后、取材前進(jìn)行.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,成年各組ApoE基因敲除小鼠在學(xué)習(xí)及記憶能力未見明顯差異(P>0.05),說明當(dāng)ApoE基因敲除小鼠成年階段并未表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙,前期研究亦表明在小鼠32周齡時(shí)動(dòng)脈硬化、高脂血癥等癥狀表現(xiàn)并不明顯.但是當(dāng)ApoE基因敲除小鼠進(jìn)入老年化階段時(shí),其認(rèn)知功能明顯減低.研究表明老年組小鼠在44周齡時(shí),實(shí)驗(yàn)成績(jī)顯示中藥組及正常組小鼠在記憶和學(xué)習(xí)能力方面明顯高于模型組小鼠(P<0.01),中藥組及正常組小鼠并無明顯差異(P>0.05).實(shí)驗(yàn)結(jié)果將定位航行實(shí)驗(yàn)中的三天測(cè)試結(jié)果相結(jié)合比較,增加了統(tǒng)計(jì)的樣本量,進(jìn)而增加了統(tǒng)計(jì)的精確度;而最后一天的空間探索實(shí)驗(yàn)由于小鼠數(shù)量有限,而且僅有一次空間探索結(jié)果,故樣本量較少,統(tǒng)計(jì)的精確度有待提高,在以后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)以提高統(tǒng)計(jì)的精確度.

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)屬癡呆范疇,其病位在心和腦,屬虛實(shí)夾雜之證,病機(jī)主要有腎精虧虛、髓海失充而導(dǎo)致腦失所養(yǎng),或由肝郁脾濕、痰阻血瘀造成腦脈痹阻.治以補(bǔ)腎填精、益智開竅、滌痰化瘀為法,佐以益氣健脾、養(yǎng)血柔肝、通絡(luò)開痹之品.通脈益智膠囊中女貞子、何首烏補(bǔ)肝益腎,填精充髓,有滋陰強(qiáng)壯之力,為君藥;丹參、赤芍活血化瘀,為臣藥;石菖蒲、遠(yuǎn)志芳香化濁,祛痰利竅,為佐藥;再配以漏蘆清熱通竅疏經(jīng),諸藥合用,共奏補(bǔ)肝益腎、化瘀祛痰、益智醒神之功.

研究發(fā)現(xiàn)[1],ApoE基因可能與記憶呈相關(guān)性. ApoE基因敲除小鼠的血腦屏障的通透性是普通小鼠的3.7倍,這就導(dǎo)致一些非必需小分子化合物進(jìn)入大腦,造成大腦功能的部分紊亂,從而可能引發(fā)老年癡呆[2].Zhang N等[3]發(fā)現(xiàn),載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)β-淀粉樣蛋白的表達(dá)高于C57BL/6J小鼠,與ApoE基因異常導(dǎo)致AD等神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)知功能障礙可能有著密切聯(lián)系.ApoE基因敲除小鼠一直被用于動(dòng)脈粥樣硬化的研究,由于其認(rèn)知功能的異常,故近期亦被用于認(rèn)知障礙的研究.

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)成年組及老年組ApoE基因敲除小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)成績(jī)可知,補(bǔ)腎祛瘀化痰法針對(duì)認(rèn)知功能障礙有一定改善作用,而且在前期研究中,補(bǔ)腎祛瘀化痰法針對(duì)血管性癡呆[4]、動(dòng)脈粥樣硬化[5]及高脂血癥等均有較好療效.本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)中藥干預(yù)ApoE基因敲除小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的研究,證明補(bǔ)腎祛瘀化痰法具有改善小鼠認(rèn)知功能的作用,為進(jìn)一步深入開展實(shí)驗(yàn)及臨床研究打下基礎(chǔ).

[1] Masliah E,SamuelW,Veinbergs I,et al.Neurodegeneration and cognitive impairment in ApoE-deficient mice is ameliorated by infusion of recombinant ApoE[J].Brain Res,1997,751(12): 307-314.

[2] Hafezi-Moghadam A,Thom as KL,Wagner DD.ApoE deficiency leads to a progressive age-dependent blood-brain barrier leakage [J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,292(4):1256-1262.

[3] Zhang N,Jia XM,Xu L,et al.The expression change of amyloid protein β in the hippocampal neurons of ApoE knockoutmice[J]. Acta Universitatis Medicinalis Anhui,2011,46(6):531-534.

[4] Wang H,Yan XP.Changes of ET and CGRP in Vascular Dementia with TongmaiyizhiCapsule[J].Journal of Beijing University of TCM,2000,23(2):64-65.

[5] Zhang TZ,Wang YX.Experiment on the Effects of Tongmaiyizhi Capsules AgainstAtherosclerosis[J].Journal of Beijing University of TCM,2002,25(5):33-37.

(本文編輯:韓虹娟)

The effects of tonifying kidney and removing stasis and phlegm on morris water maze of ApoE knockout mice

JIANG Yang,YANG Hui-min,MA Yu-qi,et al. Department of traditional Chinese medicine,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China
Corresponding author:JIANG Yang,E-mail:jiangyang310@sohu.com

Objective To assess the effects of tonifying kidney and removing stasis and phlegm on the test of morris water maze of ApoE knockout mice in adult and old groups.Methods ApoE knockout mice were divided into adult treatment group,adult model group,old treatment group and old model group. And C57BL/6J mice were divided into adult normal groups and old normal groups.When the adult groups mice were 32 weeks and the old groups were 44 weeks,the mice were tested by morris water maze.The scores of navigation experiment and space exploration experiment in morris water maze were recorded. Results The escape latency of adult rats in the treatment group,model group and normal group had no significantly difference(P>0.05).But in old rats,the escape latency of the model group was significantly longer than that of the normal group and treatment group.The space exploration experiment showed that the normal group was much better than the treatment and model groups.Conclusions The normal group and the treatment group show better scores in morris water maze than the model group.The results support that tonifying kidney and removing stasis and phlegm can improve cognitive function of old ApoE knockout mice.

Tonifying kidney and removing stasis and phlegm; ApoE knockout mice; Morris water maze

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.006

北京中醫(yī)藥大學(xué)博士自主課題(2013-JYB22-XS-128)

100035 北京積水潭醫(yī)院中醫(yī)科(姜洋、馬玉棋、梁志齊);北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院教務(wù)處(楊惠民)

姜洋(1986-),女,博士,住院醫(yī)師.研究方向:中醫(yī)老年病學(xué).E-mail:jiangyang310@sohu.com

2015-06-12)