楊　婷　莫　亞　陳莉蘋　黃秀蓉　曹　斌

補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪性近視模型多焦視網膜電圖的影響

楊婷莫亞陳莉蘋黃秀蓉曹斌

目的 通過觀察補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪性近視(form deprivation myopia,FDM)多焦視網膜電圖(multifocal electroretinogram,mf ERG)的影響,探討具有補虛化瘀功效的中藥制劑八珍顆粒是否對形覺剝奪性近視豚鼠視網膜功能有影響.方法 將16只3周齡豚鼠隨機分為兩組:模型組、補虛化瘀組,每組各8只,右眼為剝奪眼,采用半透明眼罩遮蓋誘導形覺剝奪性近視,左眼不予處理,為對照眼.補虛化瘀組予八珍顆?；鞈乙?.12 g/(kg.d),每天同一時間灌胃1次,模型組予蒸餾水1 mL灌胃1次.所有動物在造模前與造模4周后進行帶狀檢影,造模后進行多焦視網膜電圖檢查.結果 (1)經過4周形覺剝奪,豚鼠右眼向近視轉變,與造模前比較,豚鼠右眼近視屈光度有顯著改變(P<0.05),而模型組右眼屈光度與補虛化瘀組右眼屈光度比較無明顯差異(P>0.05). (2)形覺剝奪4周后,模型組右眼1、2環(huán)N1波峰時,1、2環(huán)P1峰時較模型組左眼延遲,差異有統計學意義(P<0.05);模型組右眼總波、1、2、3環(huán)N1波反應密度,總波、1、2、3、4環(huán)P1波反應密度較模型組左眼顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);補虛化瘀組右眼1環(huán)N1波峰時,總波、2環(huán)P1波峰時較模型組右眼延遲,差異有統計學意義(P<0.05).中藥制劑八珍湯顆粒組右眼總波、2、3環(huán)N1波反應密度,總波、1、2、3、4環(huán)P1波反應密度均較模型組右眼有所增加,差異有統計學意義(P<0.05).結論 補虛化瘀法有助于形覺剝奪性近視豚鼠視網膜mf ERG反應密度、峰時及其功能的恢復.

補虛化瘀; 豚鼠形覺剝奪近視模型; 多焦視網膜電圖

近年來,大量的研究表明,近視是全球最常見的視力損害的原因[1],也是發(fā)生率最高的屈光不正,目前兒童和青少年近視發(fā)病年齡提前,發(fā)病率明顯增高[2].其中19.5%在后期發(fā)展為高度近視[3],后者往往因后鞏膜葡萄腫、視網膜脈絡膜萎縮、Fuchs斑、漆裂紋及脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)[4]等嚴重并發(fā)癥出現而導致視力下降,因此對于近視應早期干預,早期進行視功能保護.現代藥理學研究證實,許多中藥具有改善微循環(huán)、抗血栓、降低血液黏滯度、提高機體抗氧化能力、清除自由基、減輕缺血再灌注損傷等多方面的藥理作用.因此,從中醫(yī)藥中發(fā)掘近視視功能保護的藥物將越來越受到醫(yī)學界的重視.筆者采用半透明眼罩遮蓋誘導形覺剝奪性近視動物模型,選取中藥制劑八珍顆粒作為干預藥物,通過屈光度、多焦視網膜電圖(multifocal electroretiongram, mf ERG)等客觀指標的變化,探討補虛化瘀法對近視視功能的保護作用.

1　材料和方法

1.1實驗動物

3周齡三色豚鼠16只,體質量180～220 g,雌雄不限(英國種,許可證號:SCXKI川72008-14,四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供).所有動物均在裝有清潔過濾器的籠子中飼養(yǎng),于室內標準化喂養(yǎng),溫度保持在22～25℃,相對濕度50%,飼料與水均自由攝取,每天補充新鮮蔬菜.納入標準:無外眼疾病;雙眼瞳孔對光反射正常;無歪頸.

1.2主要實驗材料、試劑及儀器

蒸餾水(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院);中藥制劑八珍顆粒(寧波立華制藥有限公司);復方托吡卡胺滴眼液(參天制藥株式會社,中國);0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液(S.A.ALCON-COUVREUR N.V.);帶狀光檢影鏡(中國蘇州六六公司,YZ24型);6號乳白色氣球(上海維曼乳膠制品有限公司);Reti Scan 3.15多焦電生理系統(德國Roland公司).

1.3動物分組

實驗動物購回后,適應性喂養(yǎng)3天后進入實驗程序,采用隨機法將豚鼠分為兩組,依次為模型組、補虛化瘀組,每組8只,根據豚鼠顏色進行描述標記.

1.4動物模型制備及給藥

將所有豚鼠右眼作為剝奪眼,用6號乳白色氣球(上海維曼乳膠制品有限公司)套住豚鼠頭部,剪去左眼、鼻唇部及雙耳部橡皮,使之暴露,右眼保留遮蓋[5].補虛化瘀組用中藥八珍顆?；鞈乙汗辔?.12 g/(kg.d),并將右眼剝奪眼標記為補虛化瘀組右眼,左眼未剝奪標記為補虛化瘀組左眼;模型組用蒸餾水1 mL灌胃,并將模型組右眼剝奪眼標記為模型組右眼,左眼未剝奪眼標記為模型組左眼.每天定時巡視4次,確保氣球遮蓋豚鼠右眼,喂養(yǎng)4周.每周稱體重1次,調整給藥量.

1.5屈光度測定

使用睫狀肌麻痹劑復方托吡卡胺滴眼液滴豚鼠雙眼,每5分鐘滴1次,共4次,1小時后進行帶狀光檢影驗光,由驗光經驗豐富的檢查者在未知分組情況下檢影(散光以半量計為等效球鏡).分別于造模前及造模后各檢影一次.

1.6mf ERG檢測

所有豚鼠右眼予托吡卡胺滴眼液充分散瞳至2～3 mm,暗適應30分鐘,用動物固定架將豚鼠四肢分別固定,豚鼠被放置于顯示器前約20 cm的固定架上.同時予0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液角結膜表面麻醉,刺激方法參照Ball及Nusinowitz法[6-7],刺激采用圖形同心圓排列的61個六角形,用21寸顯示器顯示.61個六角形由計算機產生二進制m-序列的假隨機序列交替出現亮幀和暗幀,單位格的局部ERG反應由計算機自動處理記錄.刺激采用1:4亮暗對比,即1個亮幀之后有4個暗幀,暗幀之后每個六角形按m-序列隨機出現亮暗幀,反復進行,47秒一個時段,每次測試共記錄4個時段.通頻帶5～100 Hz.電極均為不銹鋼針,R+極直接插入眼角膜邊緣,R-極插入前額皮下,地電極插入臀部.經放大器放大(X10,000)并濾過(1 Hz/1 kHz).以Reti Scan系統中程序對mf ERG的波形進行自動分析,分析總波形、5個環(huán)的N1波和P1波的峰潛伏(ms)、振幅(μV)并計算反應密度(nV/deg2).

1.7統計學處理

所有數據輸入計算機,采用SPSS 13.0軟件進行統計分析,計量資料以均數±標準差表示.各組間指標比較采用單因素方差分析(one-way AVOVA),屈光度、各組間mf ERG的N1波、P1波的總波、5環(huán)的峰時、反應密度方差齊性,兩組之間采用LSD比較,P<0.05為差異具有統計學意義.

2　結果

2.1各組豚鼠屈光度比較

造模前,各組間比較采用單因素方差分析, F=0.370,P>0.05,說明各組間豚鼠屈光度數相當;造模后,豚鼠各組屈光度比較經單因素方差分析,F=11.27,P<0.05,說明各組間豚鼠屈光度不全相同,兩兩比較采用LSD法,與模型組左眼比較,模型組右眼與補虛化瘀組右眼近視屈光度增大(P<0.05),說明采用氣球遮蓋造豚鼠形覺剝奪近視模型成功;補虛化瘀組右眼與模型組右眼比較,屈光度無顯著差異(P>0.05),說明補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪近視屈光度的進展無明顯的抑制作用.具體見表1.

表1　補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪性近視屈光度的影響（±s)

表1　補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪性近視屈光度的影響（±s)

注:與模型組左眼比較,aP<0.05;與模型組右眼造模前比較,bP<0.05;與補虛化瘀組右眼造模前比較,cP<0.05.

組別造模前屈光度(D)一月后屈光度(D) 0.00±3.10-0.46±1.73模型組右眼0.82±2.44-4.67±2.79ab補虛化瘀組右眼1.67±0.47-3.02±1.48模型組左眼ac

2.2各組豚鼠mf ERG結果比較

N1波峰時顯示:與模型組左眼比較,模型組右眼在1、2環(huán)的峰時明顯延遲(P<0.05),補虛化瘀組右眼在2環(huán)的峰時明顯延遲(P<0.05),說明對豚鼠形覺剝奪后,可引起mf ERG的N1波峰時的延長;模型組右眼與補虛化瘀組右眼比較,除補虛化瘀組右眼在1環(huán)的峰時明顯變短外(P<0.05),其余總波、2、3、4、5環(huán)峰時無顯著差異(P>0.05),說明補虛化瘀中藥制劑八珍顆粒對豚鼠形覺剝奪后mf ERG的N1波峰時除1環(huán)有一定恢復外,其余各環(huán)及總波均無明顯影響.見表2.

N1波反應密度顯示:與模型組左眼比較,模型組右眼在總波、1、2、3、4、5環(huán)的反應密度變化有顯著差異(P<0.05),說明豚鼠形覺剝奪后,可引起N1波除5環(huán)外的各波及總波的反應密度下降,而補虛化瘀組右眼與模型組左眼比較,除1環(huán)有顯著差異(P<0.05)外,其余總波、2、3、4、5環(huán)反應密度無顯著差異(P=0.616,0.083,0.464,0.784, 0.335>0.05),說明補虛化瘀組右眼與模型左眼N1波除1環(huán)外的反應密度相當.與模型組右眼比較,補虛化瘀組右眼在總波、2、3環(huán)反應密度增高(P<0.05),說明補虛化瘀中藥制劑八珍顆粒有助于豚鼠形覺剝奪后N1波中總波及2、3環(huán)反應密度的恢復.見表2.

P1波峰時顯示:模型組右眼與模型組左眼比較,模型組右眼P1波峰時在總波、1、2環(huán)有顯著差異(P<0.05),說明對豚鼠形覺剝奪后,可引起mf ERG的P1波峰時在總波、1、2環(huán)的延遲;模型組右眼與補虛化瘀組右眼比較,除補虛化瘀組右眼在總波、2環(huán)的峰時明顯變短外(P<0.05),其余1、3、4、5環(huán)峰時無顯著差異(P>0.05),說明補虛化瘀中藥制劑八珍顆粒對豚鼠形覺剝奪后mf ERG的P1波峰時除總波及1環(huán)有一定恢復外,其余各環(huán)均無明顯影響.見表2.

表2　補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪性近視mf ERG的影響(±s)

表2　補虛化瘀法對豚鼠形覺剝奪性近視mf ERG的影響(±s)

注:與模型組左眼比較,aP<0.05;與模型組右眼比較,bP<0.05.

組別N1波峰時(ms)反應密度(nV/deg2) P1波峰時(ms)反應密度(nV/deg2) 19.80±6.444.46±2.6046.17±2.278.32±2.47總波模型組左眼18.53±7.066.89±1.5441.34±6.1713.88±3.95模型組右眼22.19±6.382.37±2.01a67.17±6.54a7.07±4.09a補虛化瘀組右眼19.47±6.745.61±2.13b45.91±3.27b10.83±2.59ab1波模型組左眼10.96±5.4647.95±30.3928.94±9.1781.75±6.88模型組右眼29.30±7.83a29.16±22.71a41.91±8.91a54.49±5.45a補虛化瘀組右眼12.81±.6.40b29.31±33.93a36.88±2.3476.02±4.49b2環(huán)模型組左眼13.93±6.6812.08±3.7228.54±6.1722.96±11.10模型組右眼25.58±3.09a6.06±4.12a42.68±9.52a12.00±5.11a補虛化瘀組右眼22.24±5.79a11.25±3.42b29.69±2.57b20.27±5.23b3環(huán)模型組左眼18.49±13.358.14±2.7848.53±2.7314.23±4.00模型組右眼23.25±7.384.75±1.63a43.51±4.566.24±4.02a補虛化瘀組右眼20.89±7.377.27±2.48b46.81±4.2011.97±3.23b4環(huán)模型組左眼17.91±6.446.47±3.3145.43±4.1011.66±5.07模型組右眼19.16±7.043.46±1.91a41.99±5.427.73±4.61a補虛化瘀組右眼18.24±7.054.21±2.5745.72±4.9410.52±5.65b5環(huán)模型組左眼18.87±5.045.58±1.0347.15±3.259.21±4.86模型組右眼22.40±3.564.78±1.9243.94±6.686.57±3.72補虛化瘀組右眼

P1波反應密度顯示:與模型組左眼比較,模型組右眼在總波、1、2、3、4環(huán)的反應密度變化有顯著差異(P<0.05),說明豚鼠形覺剝奪后,可引起P1波除5環(huán)外的各波反應密度下降,而補虛化瘀組右眼與模型組左眼比較,總波反應密度有明顯下降(P<0.05)外,其余1環(huán)、2、3、4、5環(huán)反應密度無顯著差異(P>0.05),說明補虛化瘀組右眼與模型左眼P1波除總波外的反應密度相當;與模型組右眼比較,補虛化瘀組右眼在總波、1、2、3、4環(huán)反應密度增高(P<0.05),說明補虛化瘀中藥制劑八珍顆粒有助于豚鼠形覺剝奪后P1波中總波及1、2、3、4環(huán)反應密度的恢復.見表2.

3　討論

近視發(fā)病率高,中國學生近視發(fā)生率位居世界第二位,呈低齡化和上升趨勢[8-9].近視可發(fā)展成為高度近視,嚴重影響視功能,出現鞏膜變薄、視網膜和脈絡膜萎縮,成為常見的致盲眼病之一[10-12].研究發(fā)現9～13歲兒童在近視發(fā)展過程中已經出現中心及旁中心內層視網膜功能下降[13],年齡在18～25歲之間的高度近視患者也在沒有出現近視性視網膜病變且中心視網膜厚度在正常范圍的情況下發(fā)現有視功能下降[14].莫亞等[15]的研究發(fā)現,隨著年齡的增加,視野平均光敏感度降低,視功能下降.因此,積極探索早期近視視功能保護的方法尤為重要.

豚鼠為常用的近視動物模型[16-19].豚鼠出生后即開眼,一般在3周后給予誘導,誘導8周左右可獲得-8.00 D左右的近視.作為哺乳動物,眼球結構基本和人類相似,鞏膜組織在近視發(fā)生發(fā)展過程中細胞外基質降解,正視化機制和人類比較相似[20].本實驗選用3周齡三色豚鼠套頭罩造成形覺剝奪近視模型,造模前后,各組屈光度比較差異明顯,P<0.05(見表1),造模成功.

mf ERG可以在數分鐘內同時記錄視網膜不同部位的電反應,分別提取波形,反映視網膜不同層次細胞功能變化,有助于了解視網膜或視路病變的機制,可用于一些眼病的早期診斷及預后判斷. mf ERG波形是一個反應開始后的負向波緊隨著一個正向的雙極波,其后再一個負向波,分別為N1、P1、N2.N1反應和全視野錐細胞的a波有相同的細胞構成,P1含有全視野錐細胞的b波振蕩電位的成分[21].羅俊[22]研究推測:N1起源于視錐細胞的電活動,P1、N2起源于雙極細胞的電活動,代表視網膜內核層的電活動.而Mao X等[23]研究認為mf ERG可以敏感地反映視網膜神經節(jié)細胞的功能.Han等[24]研究認為近視度數值對后極部視網膜功能呈負相關影響mf ERG平均反應密度與視網膜視錐細胞的分布相一致,即在黃斑區(qū)密度增高,隨著離心度的增高而減少,一階反應主要代表視網膜外層細胞的功能,主要反映視錐細胞的功能狀態(tài).

中醫(yī)對近視早有認識,隋代醫(yī)家巢元方《諸病源候論》已有"目不能遠視"的記載,《審視瑤函》稱高度近視為"稟受生存近覷之病"《素問.宣明五氣篇》曰"久視傷血",認為高度近視與生俱來,或因長期過用目力,久視耗血傷精所致.血為氣之母,血虛氣亦虛,因此本研究選用具有補氣養(yǎng)血的中藥方劑八珍湯顆粒進行視功能調控.

八珍湯由四君子湯和四物湯組合而成,具有補益氣血的功效,主治氣血兩虛證,為臨床常用方劑.現代藥理研究認為八珍湯能改變血"黏" "濃""凝""聚"狀態(tài),表明其具有一定的活血化瘀作用,這可能與八珍湯中的當歸、川芎、白芍、白術等藥味的活血化瘀功效或抗血凝作用有關[25].八珍湯主要藥理作用包括改善造血功能、改善血液流變性、提高機體免疫能力、抗氧化抗衰老等[26].其中人參還能夠針對神經細胞提供系統且有效的保護[27],人參提取物人參皂苷Rg1抗氧自由基修復視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞損傷的機制是通過清除氧自由基、減少此RPE細胞脂質過氧化的發(fā)生,從而有效地抑制細胞調亡,有利于RPE細胞的生存[28-29].

本實驗發(fā)現補虛化瘀中藥制劑八珍顆粒在短時間內對豚鼠形覺剝奪性近視屈光度進展無明顯抑制作用,對于八珍顆粒在長時間內對豚鼠形覺剝奪性近視屈光度進展有無抑制作用尚待進一步研究.此外,豚鼠形覺剝奪后N1波、P1波峰時有部分延遲,反應密度有一定程度的降低,這與GAO等[30]的研究結果相似;而補虛化瘀中藥制劑八珍顆粒有助于N1波、P1波峰時、反應密度的部分恢復,推測補虛化瘀法可能對豚鼠形覺剝奪性近視模型的視功能有部分改善作用.由此,推測本實驗中八珍顆粒對豚鼠形覺剝奪近視的視網膜功能可能有一定的保護作用,提示補虛化瘀法可以部分改善豚鼠形覺剝奪性近視的mf ERG.

綜合本研究結果,推測補虛化瘀法可能對豚鼠形覺剝奪性近視的視網膜感光細胞有一定的保護作用,補虛化瘀法可能通過清除氧自由基、抑制細胞凋亡、改善視網膜血管血液流變的途徑,保護視網膜神經細胞,從而保護視功能.

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(本文編輯:禹佳)

Influences of traditional Chinese medicine of Buxu Huayu on the multifocal electroretinogram of a model of form deprivation myopia in guineas

YANG Ting,MO Ya,CHEN Li-ping,et al. Graduate School of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072,China Corresponding author:MO Ya,E-mail:myydcg@sohu.com

Objective To observe the effect of traditional Chinese medicine(TCM)of Buxu Huayu on the guinea of form deprivation myopia(FDM),and observe the effect of traditional Chinese medicine(TCM)of Bazhen granules on the retinal function of guinea of FDM.Methods 16 guineas were randomly divided into 2 groups:model control group(n=8)and Bazhen granules group(n=8),eight guineas each group.The right eyes of all guineas were form-deprived with semi-transparent membraes for 4weeks,and the left eyes were used as normal control without any treatment.Bazhen granules suspension1. 12 g/(kg.d)was given for consecutive 4 weeks in the guineas of Buxu Huayu group,and distilled water was given for consecutive 4 weeks in the guineas of model control group.Before and 4 weeks after form dep-rivation,refraction was measured by retinoscopy after cycloplegia.after given drugs or distilled water for 4 weeks,to observe the effection by multifocal electroretinogram(mf ERG).Results After 4 weeks of form deprivation,the guinea pigs's right eyes had myopic shift,and there was an approximately increase in FDM myopic refraction comparing to pre-models building;But the refraction was no obvious change between model control group and Bazhen decoction group after models builded in 4 weeks(P>0.05).The peak time of the N1 in the ring1-2 and the P1 in the total wave and ring1-2 in the model group's right eyes was statistically increased compared with that of the left eyes of the model group(P<0.05).The amplitude densities of the N1 in the total wave,ring1-3 and the P1 in the total wave,ring1-4 in right eyes of model group was statistically decreased compared with that of left eye in the model group(P<0.05).The peak time of the N1 in the ring1 and the P1 in the total wave and ring 2 in the right eyes of Buxu Huayu group was significantly decreased compared with that of right eye in the model group(P<0.05).The amplitude densities of the N1 in the total wave,ring2-3 and the P1 in the total wave,ring1-4 in the right eye of Buxu Huayu group was statistically improved compared with that of right eye in the model group(P<0.05). Conclusion Buxu Huayu can protect the visual function of guineas model of FDM by improving amplitude density and decreasing peak time of mf ERG.

Buxu Huayu; Form deprivation myopia; multfocal electroretiongram

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.004

四川省教育廳課題(11ZA065);四川省衛(wèi)生廳課題(110527);成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院科技發(fā)展基金(2012-D-YY-12)

610072 成都中醫(yī)藥大學研究生院[楊婷(碩士研究生)、曹斌(碩士研究生)];成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院眼科(莫亞、黃秀蓉);天津醫(yī)科大學總醫(yī)院濱海醫(yī)院眼科(陳莉蘋)

楊婷(1988-),女,2013級在讀碩士研究生.研究方向:中醫(yī)藥對視功能的保護.E-mail: 815396209@qq.com

莫亞(1971-),女,博士,碩士生導師,主任醫(yī)師.研究方向:中醫(yī)藥對視功能的保護.E-mail: myydcg@sohu.com

2015-05-14)