石柳柳　李賀然蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)：，江蘇蘇州215123

黑老虎中倍半萜類化合物的分離鑒定及抑制NO生成作用研究

石柳柳李賀然
蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)：，江蘇蘇州215123

目的分離鑒定黑老虎中倍半萜類化合物，并考察化合物對(duì)一氧化氮（NO）釋放的抑制作用。方法采用丙酮提取，半制備高效液相色譜等方法分離化學(xué)成分，波譜方法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；脂多糖（LPS）和γ干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞炎癥模型，考察化合物對(duì)NO釋放的抑制作用。結(jié)果分離得到了4個(gè)倍半萜類化合物，經(jīng)波譜方法鑒定，分別為匙葉桉油烯醇（1）、（-）-7βH-柳杉二醇（2）、（-）-依蘭油醇（3）、（+）-順-菖蒲烯（4）?；衔?較強(qiáng)抑制LPS/INF-γ誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生。結(jié)論化合物1～4均首次從南五味子屬中分離得到，化合物1具有抗炎活性。

黑老虎；倍半萜；NO；抑制作用

[Abstract]Objective To study the sesquiterpenes from kadsura coccinea and their nitric oxide(NO)inhibitory activities.Methods Acetone was used to extract,the compounds were iso1ated by semi-preparative HPLC method,their structures were identified by spectroscopy.The activated RAW 264.7 macrophages induced by LPS and IFN-γ were used to eva1uate the inhibitory activities on NO production.Results Four sesquiterpenes were iso1ated and identified as ent-spathu1eno1,（-）-7βH-eudesmane-4α，11-dio1,（-）-T-muuro1o1,（+）-cis-Ca1amenene.Compound 1 had strong inhibitory activity on NO production.Conclusion Compound 1-4 are obtained from the Kadsura for the first time. Compound 1 has the anti-inf1ammatory effect.

[Key words]Kadsura coccinea;Sesquiterpene;NO;Inhibitory activity

黑老虎為五味子科南五味子屬植物[Kadsura coccinea（Lem.）A.C.Smith]的根和藤莖，別名冷飯團(tuán)、緋紅南五味子、過山龍騰等。廣泛分布于我國湖北、廣東、廣西、四川、云南、貴州等西南地區(qū)。黑老虎為民間草藥，主要用于治療風(fēng)濕骨痛、跌仆扭傷、婦女痛經(jīng)、慢性胃炎等癥[1]。本課題組對(duì)黑老虎進(jìn)行了化學(xué)成分研究，并考察了部分木脂素、三萜等化合物的生物活性[2-5]，為進(jìn)一步研究黑老虎的抗炎活性成分，本次實(shí)驗(yàn)中，從黑老虎的根莖中分離得到4個(gè)倍半萜類化合物，并進(jìn)行了理化鑒定和波譜分析，并且，以脂多糖（LPS）和γ干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞炎癥模型，考察化合物對(duì)一氧化氮（NO）釋放的抑制作用。

1　儀器與材料

UV-160紫外光譜儀（島津公司，日本）；IR A2紅外光譜儀（JASCO公司，日本）；DIP-360旋光光譜儀（JASCO公司，日本）；JEOL-ECA 600 MHz核磁共振儀（Varian公司，美國，TMS為內(nèi)標(biāo)）；JEOL GC質(zhì)譜儀（Varian公司，美國）；柱層析硅膠（Wako公司，日本）；薄層色譜（Merck公司，美國）；JASCO PU-2089高效液相色譜儀（JASCO公司，日本）；高效液相色譜柱（Senshu Scientific公司，日本）；RAW264.7細(xì)胞（ATCC公司，美國）；Ham′s F12培養(yǎng)基（Sigma公司，美國）；胎牛血清（Gibco公司，美國）；谷氨酰胺（Sigma公司，美國）；IFN-γ（Genzyme/Techne公司，美國）；脂多糖（Sigma公司，美國）；磺胺（Wako公司，日本）；N-1-Naphthy1ethy1enediamine Dihydroch1oride（Wako公司，日本）；四甲基偶氮唑鹽（Wako公司，日本）；實(shí)驗(yàn)所用試劑規(guī)格均為分析純。

黑老虎根莖采集于中國廣西，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)：藥用植物研究所郭寶林博士鑒定為Kadsura coccinea（Lem.）A.C.Smith。

2　方法與結(jié)果

2.1提取與分離

黑老虎根1.75 kg粉碎后，用80%丙酮冷浸提取3次，每次24 h，合并提取液，濃縮后得到的浸膏依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別回收各萃取溶劑，得氯仿萃取物44.7 g，乙酸乙酯萃取物4.0 g，正丁醇萃取物14.2 g以及水層浸膏20.6 g。將氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到11個(gè)組分。各組分再經(jīng)硅膠、半制備高效液相色譜和Sephadex LH-20色譜分離，得到化合物1（11 mg）、2（30 mg）、3（13 mg）和4（22 mg）。

2.2 NO釋放抑制活性的測(cè)定[6]

采用RAW 264.7大鼠巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1.2×106/mL，每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，5% CO2，37℃培養(yǎng)2 h，加入LPS（終濃度為100 ng/mL）、IFN-γ（終濃度為0.33 ng/mL）、樣品DMSO溶液（溶解樣品的DMSO相對(duì)于培養(yǎng)基的含量為0.2%），培養(yǎng)16 h。取上清液100 μL，加入等體積的Griess試劑[臨用前將1%的磺胺磷酸溶液（5%）和0.1%的N-1-Naphthy1ethy1enediamine Dihydroch1oride等體積混勻]，遮光10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm（對(duì)照655 nm）測(cè)定吸光度。細(xì)胞生存率用MTT法進(jìn)行測(cè)定：剩余細(xì)胞再加入25 μL MTT（1 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄上清液，加150 μL DMSO，放置5 min，570 nm下讀取數(shù)值。

2.3化合物結(jié)構(gòu)鑒定

結(jié)合理化性質(zhì)以及光譜數(shù)據(jù)鑒定，黑老虎氯仿提取液中4個(gè)化合物結(jié)構(gòu)如下：

圖1　黑老虎中4個(gè)倍半萜類化合物的結(jié)構(gòu)式

化合物1為無色結(jié)晶，IRυmax/cm：3448，2932，1711。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：2.42（1H，dd，J=18.0，6.0 Hz，H-2a），2.03（1H，m，H-2e），1.00（1H，t，J=1.2 Hz，H-3e），1.99（1H，m，H-3a），0.70（1H，m，H-4），0.47（1H，t，J=6.0 Hz，H-5），2.19（1H，m，H-6），1.77（1H，m，H-8a），1.56（1H，m，H-8e），1.90（1H，m，H-9a），1.63（1H，m，H-9e），1.30（1H，t，J=6.0 Hz，H-10），4.68，（2H，d，J=1.0 Hz，H-11），1.28（3H，s，-CH3），1.04（3H，s，-CH3），1.05（3H，s，-CH3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.4（C-1），38.6（C-2），24.7（C-3），27.5（C-4），29.9（C-5），53.6（C-6），81.0（C-7），41.7（C-8），26.7（C-9），54.3（C-10），106.3（C-11），26.1（C-12），20.3（C-13），16.3（C-14），28.6（C-15）。上述波譜數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[7]比較，鑒定化合物1為匙葉桉油烯醇。

化合物2為無色結(jié)晶，EI-MS m/z（re1.int.%）：222 [M]+（3），207（10），164（60），149（100），59（65）；HREI-MS m/z：222.1984（[M]+，Ca1cd 222.1984 for C15H26O）；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：1.07（1H，m，H-1e），1.39（1H，m，H-1a），1.56（1H，m，H-2），1.35（1H，m，H-3e），1.79（1H，m，H-3a），1.60（1H，d，J=13.5 Hz，H-5），1.03（1H，m，H-6e），1.91（1H，m，H-6a），1.45（1H，m，H-7a），1.17（1H，m，H-7e），1.60（1H，m，H-8a），1.28（1H，m，H-8e），1.35（1H，m，H-9），1.28（3H，s，-CH3），1.29（3H，s，-CH3），1.11（3H，s，-CH3），0.89（3H，s，-CH3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：40.9（C-1），20.1（C-2），43.4（C-3），72.3（C-4），54.7（C-5），21.4（C-6），41.0（C-7），22.4（C-8），49.8（C-9），34.4（C-10），73.9（C-11），29.0（C-12），29.2（C-13），18.6（C-14），22.5（C-15）。上述波譜數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[8]比較，鑒定化合物2為（-）-7βH-柳杉二醇。

化合物3為無色結(jié)晶，EI-MS m/z（re1.int.%）：222 [M]+（15），204（50），161（60），121（80），95（100）；HREI-MS m/z：222.1982（[M]+，Ca1cd 222.1984 for C15H26O）；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：2.26（1H，m，H-1），5.56（1H，m，H-2），1.96（2H，m，H-4），1.55（2H，m，H-5），1.53（1H，m，H-6），1.54（2H，m，H-8），1.35（2H，m，H-9），1.23（1H，m，H-10），1.97（1H，m，H-11），0.83（3H，d，J=6.6 Hz，-CH3），0.88（3H，d，J=6.6 Hz，-CH3），1.19（3H，s，-CH3），1.64（3H，s，-CH3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：34.4（C-1），124.7（C-2），133.4（C-3），31.2（C-4），20.8（C-5），46.0（C-6），72.3（C-7），34.5（C-8），19.2（C-9），43.8（C-10），26.5（C-11），15.3（C-12），21.5（C-13），29.2（C-14），23.5（C-15）。上述波譜數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[9]比較，鑒定化合物3為（-）-依蘭油醇。

化合物4為無色結(jié)晶，EI-MS m/z（re1.int.%）：220[M]+（22），205（100），159（65），105（70），69（70）；HR-EI-MS m/z：220.1829（[M]+，Ca1cd 220.1827 for C15H24O）；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：7.01（1H，s，H-1），6.95（1H，dd，J=1.6，7.4 Hz，H-3），7.03（1H，d，J= 7.6 Hz，H-4），2.74（1H，m，H-6），1.34（1H，m，H-7e），1.94（1H，m，H-7a），1.59（H，m，H-8e），1.82（1H，m，H-8a），2.68（1H，m，H-10），2.23（1H，m，H-12），0.70（3H，d，J=6.9 Hz，-CH3），1.00（3H，d，J=6.9 Hz，-CH3），1.25（3H，d，J=7.0 Hz，-CH3），2.29（3H，s，-CH3）。13CNMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：128.7（C-1），134.4（C-2），126.1（C-3），126.7（C-4），140.0（C-5），32.4（C-6），30.8（C-7），21.4（C-8），43.7（C-9），139.9（C-10），31.8（C-11），17.3（C-12），21.2（C-13），22.3（C-14），21.1（C-15）。上述波譜數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[10]比較，鑒定化合物4為（+）-順-菖蒲烯。

2.4 NO釋放抑制活性

通過LPS和IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7，對(duì)4個(gè)從黑老虎中分離得到的化合物，進(jìn)行了NO產(chǎn)生抑制活性的測(cè)定，當(dāng)測(cè)試樣品濃度在10 μg/mL時(shí)，化合物4表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性（細(xì)胞生存率＜90%），進(jìn)一步降低濃度到3 μg/mL時(shí)，化合物的毒性消失，但NO產(chǎn)生抑制率也急劇降低。而化合物1在10 μg/mL時(shí)沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的NO產(chǎn)生抑制活性（NO產(chǎn)生抑制率＞75%），IC50=20.4 μmo1/L，明顯優(yōu)于陽性對(duì)照品槲皮素（IC50=25.0 μmo1/L）?；衔?、3基本沒有表現(xiàn)出NO產(chǎn)生抑制活性及細(xì)胞毒性[6]。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)從黑老虎的氯仿提取物中分離并鑒定了4個(gè)倍半萜類化合物，均為首次從南五味子屬中分離得到的化合物，豐富了南五味子屬植物所含的化合物種類。NO廣泛分布于生物體內(nèi)各組織中，是NO合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生的5個(gè)電子的氧化物；NO的水平與炎癥、癌癥、免疫異常及血管性疾病發(fā)生有密切聯(lián)系，NO的過量產(chǎn)生涉及到多種疾病的發(fā)生發(fā)展；在炎癥領(lǐng)域如感染性休克、潰瘍性結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎等；在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域如帕金森綜合征、阿爾茨海默病、癡呆都伴隨有腦組織NO的異常增多；在心血管系統(tǒng)如NO合成異常常導(dǎo)致休克、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、中風(fēng)等，因此，NO不但成為炎癥、自身免疫疾病等新的治療策略，而且已成為新藥開發(fā)的重要靶點(diǎn)，如NO供體型非甾體抗炎藥物用于抗炎、鎮(zhèn)痛，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥疾病。NO參與多種炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，與多種炎癥因子相互作用，NO在炎性反應(yīng)進(jìn)程每一階段都有產(chǎn)生，因此，可以測(cè)定NO的含量來評(píng)價(jià)某一抗炎藥物的抗炎活性[11-14]。巨噬細(xì)胞中含有誘導(dǎo)型NO合成酶，在LPS、IFN-γ等刺激下誘導(dǎo)表達(dá)可以催化精氨酸產(chǎn)生NO，因此，實(shí)驗(yàn)采用LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞炎癥模型，對(duì)分離得到的4個(gè)倍半萜化合物進(jìn)行了初步的藥理活性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木烷型倍半萜即匙葉桉油烯醇具有明顯的NO產(chǎn)生抑制作用，并且測(cè)試樣品濃度10～100 μg/mL均沒有細(xì)胞毒性。匙葉桉油烯醇存在于多種植物的揮發(fā)油中，來源廣泛、含量較高，極大有利于進(jìn)一步用炎癥動(dòng)物模型進(jìn)行抗炎作用及藥理機(jī)制的研究[15-20]。

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Identification of SesquiterPenes from Kadsura coccinea and reaserch on their Nitric Oxide inhibitory activities

SHI LiuliuLI Heran
Co11ege of Pharmacy,Soochow University,Jiangsu Province,Suzhou215123,China

R927

A

1673-7210（2016）04（a）-0027-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901853）。

石柳柳（1987.3-），男，蘇州大學(xué)2012級(jí)生物制藥專業(yè)在讀碩士研究生；主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分及其活性研究。

李賀然（1976.11-），男，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分及其活性研究。

（2015-12-21本文編輯：趙魯楓）