王振斌，劉加友，嚴(yán)賢，陳兵兵（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

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超聲輔助多菌種發(fā)酵制備葛根酵素的研究

王振斌，劉加友，嚴(yán)賢，陳兵兵
（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

以葛根為原料，植物乳桿菌和釀酒酵母為發(fā)酵菌種，在考察超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度和發(fā)酵液pH對發(fā)酵菌種產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶影響的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波促進(jìn)多菌種發(fā)酵制備葛根酵素的最佳工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明超聲波促進(jìn)多菌種混菌發(fā)酵制備葛根酵素的最佳條件為：pH為4.87，超聲時(shí)間82.95 min，超聲強(qiáng)度0.14 W/cm3時(shí)，葛根酵素的蛋白酶和脂肪酶分別達(dá)到55.32 U/mL和125.9 U/mL，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下的蛋白酶、脂肪酶酶活與預(yù)測值接近。本文旨在為超聲促進(jìn)發(fā)酵制備葛根酵素飲料提供理論支撐，也為酵素飲品的酶活指標(biāo)提供參考。

超聲；發(fā)酵；酵素；葛根

葛根為豆科葛屬（Pueraria D.C.）植物，既是傳統(tǒng)的中藥又是保健食品［1］。據(jù)報(bào)道葛根中含有超過70種功能性化合物，營養(yǎng)豐富，特別是葛根中的黃酮等三萜類化合物，在改善心腦血管循環(huán)、降低心肌耗氧量、降低血糖、防止高血壓及動(dòng)脈硬化、抗炎、祛痰、解熱、提高機(jī)體免疫力、抗菌和抗病毒等具有多種藥理作用［2-5］。利用植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵葛根液，一方面能夠保留葛根原本的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面還能提高葛根黃酮的提取率，符合葛根黃酮提取工藝的發(fā)展趨勢，最重要的是植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵還能產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶等代謝產(chǎn)物，制備一種新型保健飲料—酵素，同時(shí)也為酵素飲品中脂肪酶和蛋白酶指標(biāo)的定義提供理論參考。

酵素是一種以乳酸菌、酵母菌等益生菌發(fā)酵果品、蔬菜而形成的一種富含脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶以及乳酸、醋酸及少量乙醇等營養(yǎng)成分的液體或固體食品，具有消炎抗菌、抗氧化、解酒護(hù)肝、美白和改善腸道微環(huán)境的作用［6-9］，由于目前傳統(tǒng)的酵素生產(chǎn)周期較長、價(jià)格昂貴，因此縮短酵素發(fā)酵時(shí)間，降低酵素產(chǎn)品價(jià)格的研究需要迫切開展。

超聲波是指頻率大于20 kHz、頻率低而能量高的功率型超聲波，具有熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和生物效應(yīng)［10］。張?jiān)獦?biāo)等［11］用18 kHz，3 W的超聲波輻照海水小球藻，其生長速率可為對照組的1.86～2.26倍，脂肪酸不飽度亦比對照組提高7.7%～12.5%。研究還發(fā)現(xiàn)微生物細(xì)胞在適宜強(qiáng)度的超聲作用下也會(huì)加快生長速度。高大維等［12］采用低強(qiáng)度超聲輻照對數(shù)生長期的啤酒酵母細(xì)胞，細(xì)胞生長速率提高，細(xì)胞干重也有所增加，說明超聲波對啤酒酵母細(xì)胞有促進(jìn)生長的作用，因此本文基于上述研究，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲技術(shù)促進(jìn)植物乳桿菌和酵母菌來發(fā)酵制備葛根酵素的工藝參數(shù)，為超聲波技術(shù)在促進(jìn)葛根酵素發(fā)酵中的應(yīng)用提供參考。

1　材料和方法

1.1材料及試劑

葛根：來自句容茅寶葛業(yè)有限公司；釀酒酵母：購買于安琪酵母公司；乳酸菌：來自于江蘇大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離的植物乳桿菌；福林酚試劑：來自于國藥試劑自制；琥珀酸二辛酯磺酸鈉、異辛烷、三油酸甘油酯、油酸、吡啶、苯、醋酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等：均是分析純，來自國藥集團(tuán)的化學(xué)試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母浸膏5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫-80 1 mL，瓊脂15 g～20 g，溶解于1 000 mL水中，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4，115℃滅菌25 min。

1.2試驗(yàn)儀器

HH-A恒溫水浴攪拌器：江蘇金壇市中大儀器廠；UV1000可見光分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；TGL-16M高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；W-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；脈沖多頻掃描超聲儀：無錫市上佳生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1葛根的處理

將葛根丁60℃的熱風(fēng)烘干，60目粉碎，將葛根粉與蒸餾水按照料液比1∶15（g/mL）混合均勻，煮沸糖化1.5 h，加入50 g紅糖，30 g蜂蜜，離心取上清液，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，均分放入5個(gè)1 L錐形瓶中，滅菌，備用。

1.3.2菌種的活化

乳酸菌的活化：活化菌種在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，32℃培養(yǎng)箱中傳代2次～3次，使菌種數(shù)量達(dá)到109CFU/mL，然后加入發(fā)酵液體積的3%。

酵母菌的活化：將活性干酵母加入到2%的葡萄糖，在30℃的條件下進(jìn)行活化3 h～5 h，然后加入發(fā)酵液體積的3%。

乳酸菌菌落數(shù)根據(jù)平板計(jì)數(shù)法，參照GB 4789.35-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》；酵母菌的計(jì)數(shù)參考文獻(xiàn)［13］。

1.3.3粗酶液的分離與蛋白酶、脂肪酶酶活的測定

將發(fā)酵好的發(fā)酵液在4℃下，5 000 r/min離心20 min，取其上清液即為粗酶液。

蛋白酶酶活的測定方法參考文獻(xiàn)［14］。蛋白酶酶活定義：40℃1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪蛋白定義為一個(gè)蛋白酶活力單位（U）。

脂肪酶酶活的測定方法參考文獻(xiàn)［15］。脂肪酶定義：30℃1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol油酸所需的脂肪酶量為一個(gè)活力單位（U）。

1.3.4pH、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

1）pH對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

按照1.3.1的方法制備葛根發(fā)酵液，分別調(diào)節(jié)pH至4.5、5.0、5.5、6.0后各接入發(fā)酵液3%的乳酸菌和酵母菌，在32℃下培養(yǎng)發(fā)酵，分別在26、34、58、82、106 h考察初始pH對菌種產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響。

2）超聲時(shí)間對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

按照1.3.1的方法制備葛根發(fā)酵液，各接入發(fā)酵液3%的乳酸菌和酵母菌，然后分別在超聲30、60、90、120 min，在32℃下培養(yǎng)發(fā)酵，分別在26、34、58、82、106 h考察初始pH對菌種產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響。

3）超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

按照1.3.1的方法制備葛根發(fā)酵液，各接入發(fā)酵液3%的乳酸菌和酵母菌，然后分別超聲30、60、90、120min，在32℃下培養(yǎng)發(fā)酵，分別在26、34、58、82、106 h考察初始pH對菌種產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響。

1.3.5超聲促進(jìn)乳酸菌、酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用Box-Bohnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析確定因素水平，以蛋白酶酶活、脂肪酶酶活為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析（Response surface methodology，RSM）試驗(yàn)。試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，重復(fù)兩次，采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化乳酸菌、酵母菌發(fā)酵條件，響應(yīng)面因素與水平表見表1。

表1　因素水平表Table 1　Factor levels table

2　結(jié)果與分析

2.1pH對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

pH對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響見圖1。

圖1　pH對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.1　The influence of pH on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

由圖1可知，初始pH對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)蛋白酶酶活影響顯著。當(dāng)pH為4.5時(shí)，乳酸菌、酵母菌產(chǎn)生的酶活活性較低。當(dāng)pH為5.0時(shí)，蛋白酶酶活達(dá)到最強(qiáng)；然后隨著pH的增大，蛋白酶酶活呈現(xiàn)降低趨勢，分析原因可能是發(fā)酵液中的乳酸菌為優(yōu)勢菌群，抑制了酵母菌的生長。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，蛋白酶酶活趨向穩(wěn)定，原因可能是發(fā)酵進(jìn)程結(jié)束，沒有可利用的還原糖供乳酸菌和酵母菌利用。

pH對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)脂肪酶的影響見圖2。

圖2　pH對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.2　The influence of pH on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase

由圖2可知，初始pH對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)脂肪酶酶活具有顯著影響。在發(fā)酵26 h時(shí)，此時(shí)的脂肪酶酶活沒有較大差異，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，此時(shí)的脂肪酶酶活呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)初始pH為5.0時(shí)，發(fā)酵時(shí)間58 h，此時(shí)的脂肪酶酶活最大。

2.2超聲時(shí)間對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

超聲時(shí)間對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶的影響見圖3。

圖3　超聲時(shí)間對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.3　The influence of ultrasonic time on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

由圖3可知，超聲時(shí)間對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)蛋白酶影響顯著。在發(fā)酵初期施加90 min的超聲，發(fā)酵26 h時(shí)，乳酸菌和酵母菌產(chǎn)蛋白酶酶活上升趨勢明顯，與其他超聲組相比，蛋白酶酶的活性明顯高于其他組。

超聲時(shí)間對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)脂肪酶的影響見圖4。

圖4　超聲時(shí)間對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.4　The influence of ultrasonic time on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase on lipase

由圖4可知，超聲時(shí)間對脂肪酶酶活的影響顯著。在發(fā)酵前期分別施加不同時(shí)間的超聲，施加超聲組的脂肪酶活除超聲120 min外不僅明顯高于空白組，而且提前達(dá)到最大酶活。

2.3超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響

超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶的影響見圖5。

由圖5可知施加不同強(qiáng)度的超聲波對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)蛋白酶有明顯作用。當(dāng)施加0.05、0.10、0.20 W/cm3的超聲密度時(shí)，蛋白酶酶活在58 h達(dá)到最大；特別是施加0.15 W/cm3的超聲密度組，蛋白酶酶活顯著高于其他組，特別是空白組。

超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)脂肪酶的影響見圖6。

圖5　超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.5　The influence of ultrasonic intensity on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

圖6　超聲強(qiáng)度對乳酸菌、酵母菌產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.6　The influence of ultrasonic intensity on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase

由圖6可以看出施加不同強(qiáng)度的超聲波對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)脂肪酶作用顯著。當(dāng)施加0.20 W/cm3的超聲密度時(shí)，超聲波明顯抑制了乳酸菌和酵母菌，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，脂肪酶酶活增加顯著。由于其他超聲組施加的超聲強(qiáng)度較小，沒有對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)生較大的影響，脂肪酶酶活隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈現(xiàn)增大趨勢，特別是施加0.15 W/cm3的超聲組，脂肪酶酶活明顯高于其他組。

2.4超聲促進(jìn)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，以蛋白酶和脂肪酶酶活為響應(yīng)值，采用RSM法來尋求超聲促進(jìn)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，并利用Design Expert對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The response surface design scheme and test results

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，分別得到Y(jié)1、Y2與pH、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y1=54.59-1.43X2-1.64X3+2.4X1X2-1.76X2X3-2.88 X12-3.81X22-4.04X32

Y2=120.71-5.86X3+5.52X1X2-6.95X2X3-7.31X22-7.04X32

從表3的方差分析結(jié)果可以看出，模型顯著，回歸模型可以用來擬合3個(gè)因素對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響?；貧w方程與實(shí)際數(shù)據(jù)之間具有良好的擬合性。從因素X1、X2、X3對蛋白酶和脂肪酶的影響來看，Y1方程的一次項(xiàng)X2、X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32，交互項(xiàng)X1X2和X2X3均顯著。Y2方程的一次項(xiàng)X3，二次項(xiàng)X22、X32，交互項(xiàng)X1X2和X2X3均顯著，這說明響應(yīng)值的變化十分復(fù)雜，試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系。

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert作因子間的響應(yīng)面分析圖。如圖7、圖8、圖9、圖10所示，直觀地反應(yīng)了最為顯著的pH與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與超聲強(qiáng)度之間的交互作用對乳酸菌和酵母菌所產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶酶活的影響。

圖7　pH和超聲時(shí)間交互作用對蛋白酶酶活的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.7　Response surface and contour plot of pH and ultrasonic time interaction of protease enzyme activity

圖8　超聲時(shí)間和超聲強(qiáng)度交互作用對蛋白酶酶活的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.8　Response surface and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic intensity interaction of protease enzyme activity

圖9　pH和超聲時(shí)間交互作用對脂肪酶酶活的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.9　Response surface and contour plot of pH and ultrasonic time interaction of lipase enzyme activity

圖10　超聲時(shí)間和超聲強(qiáng)度交互作用對脂肪酶酶活的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.10　Response surface and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic intensity interaction of lipase enzyme activity

通過分析計(jì)算得到超聲促進(jìn)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵最優(yōu)條件為：pH為4.87，超聲時(shí)間82.95 min，超聲強(qiáng)度0.14 W/cm3。此條件下，蛋白酶和脂肪酶發(fā)酵的最大酶活為為55.32 U/mL和125.90 U/mL。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

為表明響應(yīng)面模型的合適性和有效性，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在pH為4.87，超聲時(shí)間82.95 min，超聲強(qiáng)度0.14 W/cm3，重復(fù)3次，蛋白酶和脂肪酶發(fā)酵的最大酶活為為（55.32±3.52）U/mL和（125.90±4.12）U/mL，接近模型預(yù)測值。

3　結(jié)論

以葛根為原料，植物乳桿菌和釀酒酵母為發(fā)酵菌種，在pH為4.87，超聲時(shí)間82.95 min，超聲強(qiáng)度0.14 W/cm3時(shí)，葛根酵素的蛋白酶和脂肪酶分別達(dá)到55.32 U/mL和125.9 U/mL。結(jié)果不僅證實(shí)可以利用葛根作為原料來生產(chǎn)植物酵素，而且還為葛根酵素酶活標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

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The Research on Preparation of Kudzu Ferment by Mixed Bacteria with Ultrasonic Wave

WANG Zhen-bin，LIU Jia-you，YAN Xian，CHEN Bing-bing
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

The kudzu and lactobacillus plantarum，saccharomyces cerevisiae were taken as material and pzymocyt respectivity.On the base of the effect of ultrasonic time，ultrasonic intensity and initial pH on protease and lipase activity，reponse surface was applicated in the optimizing process of preparation of kudzu ferment by mixed bacteria with ultrasonic wave.The results were showed that：pH 4.87，ultrasonic time 82.95 min，ultrasonic intensity 0.14 W/cm3，the protease and lipase activity were arrived at 55.32 U/mL and 125.9 U/mL.After the verification test，protease and lipase activity were closed to the predictive value.The paper was offered not merely theoretical support but also enzyme activity reference for ferment preparation.

ultrasonic wave；fermentation；ferment；kudzu

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.038

江蘇鎮(zhèn)江市科技支撐計(jì)劃（No.NY2012013；GY2012021）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）；江蘇大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（No.KYXX0047）

王振斌（1975—），男（漢），教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)酵食品加工、功能食品加工。

2015-07-03