魯?shù)ぃ徵鼔?，張虹?浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州3006；.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州3003）

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梭子蟹中硒形態(tài)分析及其分布研究

魯?shù)?，俞琰壘2，張虹2
（1.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州310016；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310013）

為研究梭子蟹中硒的賦存形態(tài)，并進(jìn)一步探究梭子蟹硒蛋白組分中硒含量的分布，以梭子蟹為研究對(duì)象，采用透析法提取有機(jī)硒、連續(xù)提取法提取不同種類蛋白質(zhì)、熱水浸提法提取多糖、原子熒光光譜法測定原料和各組分中的含硒量。結(jié)果表明：梭子蟹中64.5%的硒是以有機(jī)硒形態(tài)存在，并主要與蛋白結(jié)合（蛋白硒占總硒的48.8%）；堿溶性蛋白和水溶性蛋白是梭子蟹結(jié)合硒的主要蛋白，總結(jié)合硒量占蛋白硒含量的77.9%，按照結(jié)合硒量的多少，硒在蛋白中的分布依次是：堿溶性蛋白＞水溶性蛋白＞鹽溶性蛋白＞醇溶性蛋白；也有部分硒和多糖結(jié)合，占總硒含量的3.59%。

梭子蟹；有機(jī)硒；蛋白硒；多糖硒

硒是一種人體必需的具有抗氧化特性的微量元素，其預(yù)防人類癌癥的潛在作用已受到高度重視［1］。研究表明，硒的生物利用率與其化學(xué)形態(tài)和分布密切相關(guān)，因此，硒在天然產(chǎn)物中的形態(tài)分布極其重要［2］。隨著越來越多的硒的生理生化活性被發(fā)現(xiàn)，有關(guān)元素硒的研究逐漸延伸到生命科學(xué)領(lǐng)域。硒對(duì)人體健康的影響取決于其含量和所處的化學(xué)形態(tài)，研究證明，有機(jī)硒的生物醫(yī)學(xué)功能大于無機(jī)硒，而且毒性比無機(jī)硒小。有關(guān)硒的形態(tài)分析，有應(yīng)用聯(lián)用技術(shù)連續(xù)測定無機(jī)硒、有機(jī)硒及多種硒化物［3］，還有硒的離線分離及檢測［4-7］。

硒可通過食物鏈富集，海洋生物能從海水中富集硒，故海產(chǎn)品中硒的含量一般較高，是人們獲得硒的一個(gè)重要飲食來源。海產(chǎn)品梭子蟹肉多味美，富含蛋白質(zhì)及多種礦物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，目前有關(guān)梭子蟹中硒形態(tài)分析的研究未見報(bào)道。為獲得硒在梭子蟹中賦存形態(tài)及其分布信息，本研究運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)的原理和原子熒光光譜技術(shù)，采用分別分離純化蛋白質(zhì)和多糖，細(xì)胞蛋白質(zhì)在分離的基礎(chǔ)上，再按其與不同溶劑溶解性不同進(jìn)行分離純化，然后對(duì)硒含量進(jìn)行測定，研究了硒在梭子蟹中的賦存形態(tài)及分布規(guī)律，指導(dǎo)科學(xué)膳食。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

AFS-9130雙道原子熒光光度計(jì)：北京吉天儀器有限公司；MARS5微波消解儀：美國CEM公司；2100紫外分光光度計(jì)：尤尼科UNICO公司；SORVALL RC6超速冷凍離心機(jī)：美國Thermo公司；Labconco低溫真空冷凍干燥機(jī)：美國Labconco公司；恒溫水浴振蕩器。

丙酮；硫酸銨；氯化鋇；濃硫酸；濃硝酸；過氧化氫；濃鹽酸；透析袋（3 500 Da）：Solarbio進(jìn)口分裝；Millipore超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；0.5 mol/L氯化鈉溶液；50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）；75%（v/v）乙醇溶液；0.1 mol/L氫氧化鈉溶液；胰蛋白酶：酶活力≥2 500 U/mg；除蛋白液：正丁醇∶三氯甲烷=1∶4（v/v）；濃鹽酸（ρ1.19 g/mL）：優(yōu)級(jí)純。載流：鹽酸（2+98）：濃鹽酸20 mL，用水稀釋至1 000 mL。硼氫化鈉（10 g/L）-氫氧化鈉（5 g/L）溶液：稱取5.0 g氫氧化鈉溶于約200 mL水中，加入10 g硼氫化鈉，溶解后用水稀釋并定容至1 000 mL，搖勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。鐵氰化鉀（100 g/L）：稱取10 g鐵氰化鉀用水溶解后以水稀釋到100 mL，搖勻。硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 000 mg/L（國家鋼鐵材料測試中心），硒標(biāo)準(zhǔn)使用液（1.0 μg/mL）：由硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備用以鹽酸（2+98）逐級(jí)稀釋而成。

1.2儀器工作條件

1.2.1微波消解條件

功率1 600 W，120℃，升溫時(shí)間5 min，保持時(shí)間5 min；180℃，升溫時(shí)間5 min，保持時(shí)間15 min。

1.2.2順序注射-氫化物發(fā)生-原子熒光光度儀測定條件

光電倍增管負(fù)高壓：300 V；載氣流量：400 mL/min；屏蔽氣流量：800 mL/min；燈電流：80 mA；原子化器高度：8 mm；原子化溫度：200℃；進(jìn)樣量：1 mL；測量方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時(shí)間：1.5 s；讀數(shù)時(shí)間：7 s。

1.3方法

1.3.1有機(jī)硒的提取與測定

采用持續(xù)透析法，稱取20 g梭子蟹試樣（精確到0.1 mg）裝入透析袋中，加入300 mL水在燒杯中透析96 h，每隔12小時(shí)換一次水，直至用10%BaCl2檢驗(yàn)透析外液中無SO42-。將透析后樣品真空冷凍干燥，測定硒含量［8-9］。

1.3.2不同種類硒蛋白的提取及其結(jié)合態(tài)硒含量的測定

1.3.2.1總可溶性硒蛋白的提?。?0］及其結(jié)合態(tài)硒含量測定

準(zhǔn)確稱取15 g梭子蟹試樣（精確至0.1 mg）至燒杯中，加入0.25mol/L NaOH450 mL，室溫下攪拌提取4 h，過濾，得到上清液。濾渣加0.25 mol/L NaOH溶液200 mL反復(fù)提取2次，合并3次濾液，加入硫酸銨至飽和度為95%，4℃靜置12 h。8 000 r/min離心10 min沉淀以pH8.0 Tris-HCl緩沖液50 mL溶解。4℃下用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液1 L透析3次（至用10% BaCl2檢驗(yàn)呈陰性后）。所得蛋白質(zhì)溶液真空冷凍干燥，測定硒含量。

1.3.2.2水溶性硒蛋白的提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測定

準(zhǔn)確稱取梭子蟹試樣15 g（精確至0.1 mg），加入90 mL經(jīng)-40℃預(yù)冷的丙酮，冰上攪拌脫脂3 h，4℃8 500 r/min離心15 min，棄上清，揮干丙酮。沉淀加入450 mL水，室溫下攪拌提取4 h，4℃8 500 r/min離心15 min，取上清液。重復(fù)2次，合并3次所得上清液，加入硫酸銨至飽和度為95%，4℃靜置過夜，離心收集沉淀，用少量去離子水溶解，4℃下依次用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液、去離子水透析（3.5 kDa），至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%BaCl2檢驗(yàn)呈陰性。所得蛋白質(zhì)溶液真空冷凍干燥，測定硒含量。

1.3.2.3鹽溶性硒蛋白的提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測定

在提取水溶性蛋白后的殘?jiān)?，加?.5 mol/L氯化鈉溶液450 mL，室溫下攪拌提取4 h，4℃8 500 r/min離心15 min，取上清液。重復(fù)2次，合并3次所得上清液，加入硫酸銨至飽和度為95%，4℃靜置過夜，離心收集沉淀，用0.5 mol/L氯化鈉溶液溶解、透析。所得蛋白質(zhì)溶液真空冷凍干燥，測定硒含量。

1.3.2.4醇溶性硒蛋白的提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測定

在提取鹽溶性蛋白后的殘?jiān)?，加?5%（v/v）乙醇溶液450 mL，室溫下攪拌提取4 h，4℃8 500 r/min離心15 min，取上清液。重復(fù)2次，合并3次所得上清液，加入硫酸銨至飽和度為95%，4℃靜置過夜，離心收集沉淀，用75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶解、透析。所得蛋白質(zhì)溶液真空冷凍干燥，測定硒含量。

1.3.2.5堿溶性硒蛋白的提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測定

在提取醇溶性蛋白后的殘?jiān)?，加?.1mol/L氫氧化鈉溶液450mL，室溫下攪拌提取4 h，4℃8 500 r/min離心15 min，取上清液。重復(fù)2次，合并3次所得上清液，加入硫酸銨至飽和度為95%，4℃靜置過夜，離心收集沉淀，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解、透析。所得蛋白質(zhì)溶液真空冷凍干燥，測定硒含量。

1.3.3可溶性硒多糖的提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測定

準(zhǔn)確稱取梭子蟹試樣15 g（精確至0.1 mg），加入90 mL經(jīng)-40℃預(yù)冷的丙酮，冰上攪拌脫脂3 h，4℃8 500 r/min離心15 min，棄上清液，揮干丙酮。沉淀加入水375 mL，75℃水浴浸提5 h，8 500 r/min離心15 min，收集上清液。加入3倍體積乙醇，4℃靜置過夜，離心收集沉淀。沉淀用去離子水溶解，冷凍干燥得到粗多糖。采用胰蛋白酶+Sevag法脫蛋白，用3倍體積乙醇沉淀多糖，沉淀用去離子水溶解后，透析［11］。所得多糖溶液真空冷凍干燥，測定硒含量。

1.3.4蛋白質(zhì)含量的測定

考馬斯亮藍(lán)G-250染色法［12］。

1.3.5多糖含量的測定

苯酚-硫酸比色法［13］。

1.3.6總硒含量的測定

微波消解-氫化物原子熒光法［14］。

2　結(jié)果與討論

2.1梭子蟹中水分、粗蛋白、總糖的測定

本試驗(yàn)測得新鮮梭子蟹肉中水分、粗蛋白、總糖含量見表1。

表1　梭子蟹中水分、粗蛋白、總糖的測定結(jié)果（n=3）Table 1　Determination results of moisture，crude protein，total sugar in swimming crab（n=3）

2.2梭子蟹中硒的分布

將梭子蟹中有機(jī)硒提取后測定其中硒含量，總硒與有機(jī)硒之差即為無機(jī)硒含量，結(jié)果見表2。

表2　梭子蟹中總硒、有機(jī)硒、無機(jī)硒含量的測定結(jié)果（n=5）Table 2　Determination results of Contents of total Se，organic Se and inorganic Se in swimming crab（n=5）

由表2可知，梭子蟹是富硒食品［15］，且梭子蟹中有機(jī)硒占總硒的64.5%，無機(jī)硒占總硒的35.5%。由此可見，有機(jī)硒是梭子蟹中硒的主要賦存形態(tài)。

2.3梭子蟹中有機(jī)硒的分布

將梭子蟹中的蛋白質(zhì)和多糖分別提取、純化后測定其中硒含量，結(jié)果見表3。

表3　梭子蟹中有機(jī)硒的分布（n=5）Table 3　Distribution of organic Se in swimming crab（n=5）

由表3可知，梭子蟹中與蛋白質(zhì)結(jié)合的硒占有機(jī)硒的75.7%、總硒的48.8%，與多糖結(jié)合的硒占有機(jī)硒的5.57%、總硒的3.59%，其他形態(tài)結(jié)合的占有機(jī)硒的18.7%，包括脂肪硒和一些小分子硒化合物。按照結(jié)合硒量的多少，有機(jī)硒和總硒在蛋白質(zhì)和多糖中的分布為蛋白質(zhì)硒＞多糖硒。這說明蛋白質(zhì)硒是梭子蟹中硒的主要賦存形態(tài)，但也有部分硒與多糖等非蛋白質(zhì)形式存在。

2.4梭子蟹中蛋白硒的分布

為進(jìn)一步獲得梭子蟹中蛋白硒的分布信息，根據(jù)蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解性不同，采用連續(xù)提取法依次用水、氯化鈉溶液、乙醇溶液和氫氧化鈉溶液為溶劑提取梭子蟹中的水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白，蛋白質(zhì)溶液經(jīng)透析、真空冷凍干燥后，測定其中硒含量。結(jié)果見表4。

表4　梭子蟹中蛋白硒的分布（n=5）Table 4　Distribution of protein-bound Se in swimming crab（n=5）

由表4可知，硒在四種不同溶解性的蛋白質(zhì)中的分布不等。堿溶性蛋白中硒的含量最高（占總有機(jī)硒的41.1%），而鹽溶性蛋白質(zhì)最少（占總有機(jī)硒的7.92%）。而以75%乙醇提取的蛋白未檢測到硒。這一結(jié)論和巴西堅(jiān)果的測定一致［16］。按照結(jié)合硒量由大到小依次為：堿溶性蛋白結(jié)合硒（占蛋白硒54.3%）＞水溶性蛋白結(jié)合硒（占蛋白硒23.6%）＞鹽溶性蛋白結(jié)合硒（占蛋白硒10.5%）＞醇溶性蛋白結(jié)合硒（未檢出）。由此可見，堿溶性蛋白和水溶性蛋白是梭子蟹結(jié)合硒的主要蛋白，總結(jié)合硒量占總蛋白硒含量的77.9%、占總有機(jī)硒含量的59.0%、占總硒含量的38.0%。開發(fā)利用梭子蟹中蛋白硒，主要以堿溶性蛋白和水溶性蛋白為主。

2.5回收率和精密度試驗(yàn)

采用添加法在總硒本底含量為0.529 mg/kg的梭子蟹肉中添加0.100、1.00、2.00 mg/kg 3個(gè)不同濃度水平的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率和精密度測定。每個(gè)濃度水平單獨(dú)測定6次，結(jié)果回收率為94.0%～102%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.80%～2.61%，提示本法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

3　結(jié)論

有機(jī)硒是梭子蟹中硒的主要賦存形態(tài)，且主要是蛋白硒，其結(jié)合的硒量占有機(jī)硒的75.7%、總硒量的48.8%。按照結(jié)合硒量的多少，有機(jī)硒和總硒在蛋白質(zhì)和多糖中的分布為蛋白質(zhì)硒＞多糖硒。堿溶性蛋白和水溶性蛋白是梭子蟹結(jié)合硒的主要蛋白，總結(jié)合硒量占總蛋白硒含量的77.9%、占總有機(jī)硒含量的59.0%、占總硒含量的38.0%。表明梭子蟹中大多數(shù)的含硒蛋白可能是酸性的或極性較強(qiáng)的蛋白。本研究為合理開發(fā)利用富硒海產(chǎn)品，幫助人們合理選擇健康的富硒產(chǎn)品，科學(xué)膳食和選擇補(bǔ)硒產(chǎn)品及完善富硒海產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)提供了重要的理論依據(jù)。

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Study on Distribution and Combined Forms of Selenium in Swimming Crab

LU Dan1，YU Yan-lei2，ZHANG Hong2
（1.Zhejiang Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 310016，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310013，Zhejiang China）

For studying the combined form of selenium in swimming crab，and further Exploreing the distribution of swimming crab selenium content in selenium protein components，organic selenium was extracted by dialysis method，different proteins were extracted by continuous extraction method，and polysaccharides were extracted with hot water，the contents of selenium were determined by atomic fluorescence spectrometry.The results showed that 64.5%of total Se were in the organic form，and mainly associated with the protein in swimming crab.Se bound to the protein extracts accounted for 48.8%of total Se.Moreover，77.9%of Se bound to protein was incorporated with alkali-soluble and water-soluble protein extracts.The amount of Se existed in the different protein fractions decreased in the order of alkali-soluble，water-soluble，sodium chloride-soluble and ethanol-soluble protein extracts，and 3.59%of selenium was observed to be bound to polysaccharides.

swimming crab；organic selenium；protein selenium；polysaccharide selenium

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.026

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011IK247）

魯?shù)ぃ?964—），女（漢），研究員，學(xué)士，研究方向：食品元素及其形態(tài)分析。

2015-03-30