王海東，姜水紅，查圣華，張宏（北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司，北京100085）

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透明質(zhì)酸海洋膠原肽粉中β-胡蘿卜素的測定

王海東，姜水紅，查圣華，張宏
（北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司，北京100085）

建立透明質(zhì)酸海洋膠原肽粉中β-胡蘿卜素的含量測定方法。樣品經(jīng)淀粉酶處理后，用乙醇和三氯甲烷提取，離心，取上清液水浴蒸干，殘?jiān)靡掖既芙夂筠D(zhuǎn)移至氧化鋁柱進(jìn)行層析純化。采用Waters XBridgeTMShield RP18色譜柱，以甲醇∶乙腈=90∶10（體積比）為流動相，PDA檢測器檢測。結(jié)果表明，在0～50 μg/mL范圍內(nèi)β-胡蘿卜素呈線性關(guān)系（R2＞0.999），回收率為100.0%（RSD=2.3%，n=6）。該含量測定方法可用于以β-胡蘿卜素為原料的保健食品的檢測。

β-胡蘿卜素；HPLC；含量

類胡蘿卜素是四萜類化合物。在眾多類胡蘿卜成分之中，β-胡蘿卜素作為維生素A的前體，早已備受臨床醫(yī)藥界的關(guān)注。近年來隨著類胡蘿卜素的應(yīng)用與研究在臨床醫(yī)學(xué)、臨床藥理、食品工業(yè)、及化妝品工業(yè)的迅猛發(fā)展，特別是90年代以來，有關(guān)專家對其作用機(jī)制在流行病學(xué)、保健預(yù)防疾病的作用方面進(jìn)行了廣泛和深入的研究探討，并取得了相當(dāng)?shù)某晒?］。β-胡蘿卜素不僅是人體內(nèi)維生素A的重要來源，而且其本身對人體也具有很重要的生理功能，它可以預(yù)防、延緩和治療某些疾病，尤其是癌癥，同時(shí)也能提高機(jī)體的免疫功能［2］。β-胡蘿卜素還作為食品添加劑和營養(yǎng)增補(bǔ)劑，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）食品添加劑聯(lián)合專家委員會推薦，被認(rèn)為A類優(yōu)秀和有營養(yǎng)的食品添加劑［3］。近年來國內(nèi)對其關(guān)注越來越高，其研究和探討也十分活躍。

目前一些添加了β-胡蘿卜素成分的保健食品為了保證該成分的穩(wěn)定性，對其進(jìn)行了包埋處理，當(dāng)采用國標(biāo)法GB/T 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》第一法進(jìn)行測定時(shí)，結(jié)果比添加量明顯偏低，針對這一現(xiàn)象，該文在國標(biāo)法基礎(chǔ)上，增加了樣品去包埋前處理過程，并對修改后的方法進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證。

1　材料與方法

1.1儀器

2695-2998高效液相色譜儀：美國Waters公司；CPA225D電子天平：德國Sartorius公司；3-15離心機(jī)：德國Sigma公司；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-D-4電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2試劑

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，30.9%），甲醇和乙腈（色譜純，J.T.Baker），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3樣品

透明質(zhì)酸海洋膠原肽粉由北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司提供。

2　方法

2.1色譜條件

色譜柱：Waters XBridgeTMShield RP18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相∶甲醇∶乙腈=90∶10（體積比）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：448 nm；柱溫：30℃。

2.2標(biāo)準(zhǔn)液

精確稱取β-胡蘿卜素32.36 mg于燒杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗滌燒杯數(shù)次，溶液轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，濃度為100 μg/mL。

2.3試樣制備（以下操作需避光進(jìn)行）

2.3.1試樣提取

取樣品約1 g，精密稱定，置于250 mL容量瓶中，再加入0.2 g淀粉酶，加10 mL 60℃的蒸餾水，并在60℃水浴中超聲5min，加入100mL無水乙醇和100mL三氯甲烷，再次水浴超聲處理5 min，冷卻后加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，取出部分內(nèi)容物置于具塞離心管內(nèi)離心5 min（轉(zhuǎn)速約4 000 r/min），吸取上清液5 mL于蒸發(fā)皿中，置于40℃水浴上揮干，然后加1 mL（95%）乙醇溶解殘?jiān)?/p>

2.3.2純化

將2.3.1的試樣提取液殘?jiān)芙庖?，用少量石油醚溶解，然后進(jìn)行氧化鋁層析。氧化鋁柱為1.5 cm（內(nèi)徑）× 4 cm（高）。先用洗脫液丙酮+石油醚（丙酮與石油醚體積比為5∶95）洗氧化鋁柱，然后再加入溶解試樣提取液的溶液，用丙酮+石油醚（5+95）洗脫β-胡蘿卜素，控制流速為20滴/min，收集于10 mL容量瓶中，用洗脫液定容至刻度。用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液做HPLC分析用［4］。

2.4線性關(guān)系考察

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，各加移動相至刻度，搖勻后，分別取20 μL注入液相色譜儀，測定，以β-胡蘿卜素含量為橫坐標(biāo)，以β-胡蘿卜素峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)

取同一試樣溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，以β-胡蘿卜素峰面積計(jì)，計(jì)算6次峰面積的RSD。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1份樣品溶液，在4℃避光密封儲存條件下，分別于0、6、12、24、36、48、72 h時(shí)取出，緩溫至室溫，測定。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取樣品6份，制備試樣溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，計(jì)算β-胡蘿卜素的含量。

2.8加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量樣品6份，分別置250 mL量瓶中，加10 mL 60℃的蒸餾水，再加入0.2 g淀粉酶，并在60℃水浴中超聲5 min，加入100 mL無水乙醇和100 mL三氯甲烷，然后加入對照品溶液（1 952 μg/mL）1.0 mL，按2.3方法繼續(xù)制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測定含量。

2.9檢出限與定量限

配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取20 μL注入液相色譜儀，以β-胡蘿卜素峰計(jì)算信噪比。

3　結(jié)果

3.1線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝207 427x-13 758，R2= 0.999 6，線性范圍：0～50 μg/mL，線性良好，見圖1。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)品重疊譜圖Fig.1　Overlapping spectra of the standard

3.2精密度實(shí)驗(yàn)

6次峰面積的RSD=0.2%，進(jìn)樣精密度良好，見圖2。

圖2　進(jìn)樣精密度重疊譜圖Fig.2　Overlapping spectra of the sampling precision

3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果以β-胡蘿卜素峰面積計(jì)，RSD=0.63%，說明樣液在72 h內(nèi)穩(wěn)定，見圖3。

圖3　試樣溶液穩(wěn)定性重疊譜圖Fig.3　Overlapping spectra of sample solution stability

3.4重復(fù)性試驗(yàn)

6份樣品結(jié)果的RSD=1.2%，試驗(yàn)重現(xiàn)性良好，見表1。

表1　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1　The results of the repetitive experiment

3.5加標(biāo)回收率

β-胡蘿卜素的平均回收率為100.0%，RSD=2.3%。見表2。

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The results of the recovery experiment

3.6檢出限與定量限

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01 μg/mL時(shí)，信噪比為4.6＞3，可設(shè)為檢出限；濃度為0.03 μg/mL時(shí)，信噪比為14.4＞10，可設(shè)為定量限，并對其重復(fù)進(jìn)樣6次，以β-胡蘿卜素峰面積計(jì)，RSD為2.5%，精密度良好，見表3和表4。

表3　標(biāo)準(zhǔn)溶液信噪比Table 3　The signal-to-noise ratio of the standard solution

表4　定量限重復(fù)性Table 4　The repetitive experiment ofthe loq

4　結(jié)論

β-胡蘿卜素在448 nm處吸收峰峰形對稱良好，無過多干擾峰；此方法樣品分析時(shí)間短，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及準(zhǔn)確度良好，在0～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可為保健食品及原料中β-胡蘿卜素的含量測定提供參考。

5　討論

樣品中β-胡蘿卜素因?yàn)榧影裉幚?，直接用國?biāo)法GB/T 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》中第一法檢測，結(jié)果比實(shí)際添加量偏低很多，所以添加淀粉酶去包埋處理樣品，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。同時(shí)試驗(yàn)要注意在避光下操作，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)低溫避光保存，而且最好以新購未開封標(biāo)準(zhǔn)品為宜，否則將對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

［1］王慶偉.類胡蘿卜素的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用［J］.中國藥事，2000，14（1）:58-60

［2］朱秀靈，車振明，徐偉，等.β-胡蘿卜素的生理功能及其提取技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.廣州食品工業(yè)科技2004，20（2）:158-162

［3］唐劉蘊(yùn)泉，蔡皓.β-胡蘿卜素應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2005，12（2）:121-123

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003:3-4

Determining the Content of Carotenoids in Hyaluronic Acid Marine Collagen Peptide Powder

WANG Hai-dong，JIANG Shui-hong，ZHA Sheng-hua，ZHANG Hong

（Beijing TongRenTang Health-Pharmaceutical Co.，Ltd.，Beijing 100085，China）

A practical method for determining the content of carotenoids in hyaluronic acid marine collagen peptide powder was established.After the samples were processed by amylase，extracted with ethanol and chloroform，centrifugal，and the extract was to dry in a water bath，then the residue after dissolved with ethanol and transferred to the alumina column chromatography purification.Using the chromatographic column of Waters XBridgeTMShield RP18；mobilephase，methanol∶acetonitrile=90∶10（volume ratio）；tested with the PDAdetector.Result showed that the linear relationship was good in the range of 0-50 μg/mL for carotenoids，（R2＞0.999）.The recovery of carotenoids was 100.0%（RSD=2.3%，n=6）.This method can be used for detecting health care food with beta carotene as raw materials.

β-carotene；HPLC；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.023

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2014AA022109）

王海東（1987—），男（漢），助理工程師，學(xué)士，研究方向：食品藥品質(zhì)量研究。

2015-07-09