吉海龍，史鵬飛，周　潔，毛天明，羅永康，陳　茜，周開宇△

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院，浙江 溫州 325000；2.浙江省臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，臺州 318000；3.浙江省臺州市立醫(yī)院神經(jīng)外科，臺州 318000；4.浙江省臺州市立醫(yī)院病理科，臺州 318000)

?

脾源性酪氨酸激酶基因啟動子甲基化與髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

吉海龍1，史鵬飛1，周潔2，毛天明3，羅永康3，陳茜4，周開宇1△

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院，浙江 溫州 325000；2.浙江省臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，臺州 318000；3.浙江省臺州市立醫(yī)院神經(jīng)外科，臺州 318000；4.浙江省臺州市立醫(yī)院病理科，臺州 318000)

目的：探討甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-CdR)抑制脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因啟動子的甲基化后對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法：用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理體外培養(yǎng)的髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞，通過甲基化特異性PCR(MSP)、Real time-PCR、Western blot及Transwell實驗方法分別檢測不同濃度5-aza-CdR處理后髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因啟動子區(qū)甲基化、mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)及細(xì)胞穿膜數(shù)的變化。結(jié)果：髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中Syk基因啟動子存在過甲基化，與對照組比較，經(jīng)不同濃度5-aza-CdR處理后，其Syk基因啟動子區(qū)甲基化受到不同程度抑制，Syk mRNA的表達(dá)量最高上調(diào)(3.40±0.24)倍(P<0.01)；Syk蛋白的表達(dá)量最高上調(diào)(3.23±0.19)倍(P<0.01)；細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中Syk基因啟動子甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，可能是髓母細(xì)胞瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一；而甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR可抑制其啟動子區(qū)的甲基化，使Syk的表達(dá)水平上調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

髓母細(xì)胞瘤；脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因；甲基化；5-氮雜-2-脫氧胞苷；侵襲轉(zhuǎn)移

髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma,MB)是一種兒童最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，其治療手段主要包括手術(shù)切除和術(shù)后放化療，隨著手術(shù)技巧與放化療策略的逐步改進(jìn)，患者的5年生存率有所提高，但仍有相當(dāng)一部分患者死于腫瘤的早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而放化療所帶來的嚴(yán)重的認(rèn)知障礙、生長發(fā)育遲滯、血液系統(tǒng)抑制及內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂等后遺癥，使大部分存活者飽受折磨。近年來隨著對MB發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究的深入，分子靶向治療引起人們的重視。相對傳統(tǒng)的術(shù)后放化療，分子靶向治療藥物毒性低，更有針對性，產(chǎn)生的后遺癥也較少。但面臨的首要問題是MB發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全明確。WHO將MB分為Ⅵ級：經(jīng)典型(classic medulloblastoma)、促纖維增生/結(jié)節(jié)型(desmoplastic/nodular medulloblastoma,D/N)、廣泛結(jié)節(jié)形成型(medulloblastoma with extensive nodularity,MBEN)、大細(xì)胞型(large cell medulloblastoma)和間變型(anaplastic medulloblastoma)，其中大細(xì)胞型和間變型預(yù)后最差，統(tǒng)稱為LC/A型。部分學(xué)者為更好的解釋患者預(yù)后差異，從基因與分子水平將MB進(jìn)一步分為Wnt型、SHH型、Group 3和Group 4四種類型[1]。這四種類型在發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)、預(yù)后等方面都有明顯區(qū)別，相較傳統(tǒng)病理分型，新的分型可以更好的反映出了腫瘤的生物學(xué)行為和惡性程度，也為分子靶向治療藥物的尋找提供了更明確的方向。

脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是一種蛋白酪氨酸激酶，在適應(yīng)性免疫受體信號途徑有重要的作用，還參與調(diào)節(jié)其他多種生物功能，包括細(xì)胞粘附、固有免疫識別、破骨細(xì)胞成熟、血小板激活及血管形成等[2]。自從Syk首次被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的侵襲性相關(guān)，具有抑癌作用后，Syk作為一個具有抑癌作用的蛋白酪氨酸激酶成為研究熱點。現(xiàn)已有大量研究表明[2,3]，在多種惡性腫瘤中Syk基因都存在啟動子區(qū)的甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)降低或缺失，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后等。而Syk與MB的發(fā)生發(fā)展及其生物學(xué)行為的關(guān)系尚不明確。本研究將探討Syk在MB中是否存在甲基化及其與MB侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料

髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞購自美國ATCC公司；甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza -2-deoxycytidine，5-aza-CdR)購自Sigma公司；RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司；兔抗人Syk單克隆抗體(D3Z1E)購自Cell Signaling公司；兔抗人GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自北京索來寶生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及PBS緩沖液購自Gibco公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit(D5005)購自ZYMO Research公司；2×Taq PCR MasterMix、SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及甲基化特異性PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；DNA提取試劑盒購自凱基生物公司；Transwell小室(3422，孔徑8.0 μm，直徑6.5 mm)購自Corning公司；Matrigel Basement Membrane Matrix 購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中(pH7.2)，在37℃、含5%CO2濕潤空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁至80%～90%時，用胰蛋白酶消化后按5×104cells/ml每瓶接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞完全貼壁后，用含有不同濃度的5-aza-CdR(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)的培養(yǎng)液給細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞。

1.3DNA提取及MSP(甲基化特異性PCR)

以PBS漂洗細(xì)胞兩次后胰酶消化，將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至離心管中離心收集細(xì)胞，按DNA提取試劑盒說明書，以離心吸附柱法提取細(xì)胞基因組DNA。按照EZ DNA Methylation-Gold KitTM試劑盒操作步驟對提取的DNA樣品進(jìn)行處理，使未甲基化的的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。簡述如下：取DNA樣品20 μl，加入130 μl CT Conversion Reagent，98℃加熱10 min，64℃處理2.5 h，轉(zhuǎn)移到一個Zymo-Spin IC管中，再加入600 μl M-Binding Buffer，10 000×g離心30 s；加100 μl M-Wash Buffer，12 000×g離心30 s；加入200 μl M-Desulphonation Buffer，室溫放置15～20 min；12 000×g離心30 s后加入200 μl M-Wash Buffer 12 000×g離心30 s,并重復(fù)一次；將10 μl M-Elution Buffer 直接加到吸附柱基質(zhì)中并12 000×g離心30 s洗脫DNA。修飾后的DNA于-20℃保存。采用巢式PCR對甲基化和非甲基化序列進(jìn)行擴(kuò)增。巢式PCR反應(yīng)各引物序列及反應(yīng)條件參照Yuan[6]等文獻(xiàn)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后在凝膠分析系統(tǒng)檢測并分析。

1.4RT-PCR

按Trizol試劑說明書操作提取經(jīng)不同濃度5-aza-CdR處理后的細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計測定其A260/A280，比值在1.8～2.1之間為符合純度要求。以瓊脂糖凝膠電泳檢測18 S和28 S以觀察其完整性。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)體系20 μl：取各處理組細(xì)胞總RNA 2 μl，oligo(dT)15 2 μl，Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)2 μl，RNase-Free ddH2O定容至14.5 μl，70℃加熱5 min后迅速冰上冷卻2 min，簡短離心后加入4 μl 5×First-Strand Buffer(含DTT)，0.5 μl Rnasin，加入1 μl(200U)TIANScript M-MLV，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應(yīng)，置于冰上，用RNase-Free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋至50 μl。參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書，分別加入2 μl上述cDNA溶液，2.5×RealMasterMix/20×SYBR Solution混合反應(yīng)液9 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl，加ddH2O定容至20μl。置于美國Applied Biosystems公司的Step One Real-Time PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。Real-time PCR以GAPDH基因為內(nèi)參照。Syk引物序列為：F：5’-CATGTCAAGGATAAGAA-3’，R：5’-AGTTCACCACGTCATAGTAGTAATT-3’；GAPDH引物序列為：F：5’-CATCAGCAATGCCTCCTGCAC-3’，R：5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’。結(jié)果用相對定量法(Comparative Delta-delta Ct)計算。

1.5Western blot

將不同濃度5-aza-CdR處理后的細(xì)胞分別用5 ml預(yù)冷的PBS液漂洗兩次后各加入250 μl預(yù)冷的RIPA裂解液，置于冰上20 min使其充分裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清，用BCA法檢測蛋白濃度。于樣品中加入5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，100℃變性10 min。制作10%分離膠和5%濃縮膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，按藥物濃度由低到高的順序加樣進(jìn)行電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min，置于曝光儀中進(jìn)行檢測。每個樣本重復(fù)3次。實驗以GAPDH蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參照，利用圖像分析軟件對各條帶進(jìn)行分析，以Syk蛋白條帶與GAPDH條帶的比值作為Syk蛋白的相對表達(dá)量。

1.6細(xì)胞體外侵襲實驗

Matrigel從-20℃取出，4℃解凍后置于冰上，以0℃預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)基將matrigel稀釋至50 mg/L，按每孔50 μl加入Transwell小室的上室，超凈臺內(nèi)風(fēng)干過夜。使用前每孔加入100 μl含1%BSA的無血清DMEM培養(yǎng)液，37℃靜置1 h后吸去小室內(nèi)液體備用。將經(jīng)0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L的5-aza-CdR處理72 h的Daoy細(xì)胞制成3.0×105cells/ml的細(xì)胞懸液，每孔200 μl加入Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室取出，以90%乙醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，自來水漂洗5 min,然后用棉簽將小室濾膜上室面的細(xì)胞及Matrigel小心拭去，將小室置于33%醋酸溶液中洗滌10 min以脫色，取洗脫液于紫外分光光度計測570 nm處吸光度值，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7細(xì)胞體外遷移實驗

實驗中Transwell小室的上室面無Matrigel包被，穿膜時間設(shè)定為12 h，其余操作與細(xì)胞侵襲實驗相同。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1Syk基因啟動子區(qū)甲基化情況

甲基化特異性PCR產(chǎn)物電泳檢測發(fā)現(xiàn)，髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞Syk基因啟動子區(qū)存在甲基化，經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理后，Syk基因的甲基化被抑制(圖1)。

Fig.1MSP was carried out to detect Syk gene promotor methylation status of Daoy cell line

MSP:Methylation specific PCR;ME:Methylated;UM:Unmethylated;M:DL2000 Marker;1-3:Drug groups;4-6:Control groups

2.25-aza-CdR對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中Syk mRNA表達(dá)的影響

髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞經(jīng)不同濃度的5-aza-CdR處理不同時間后，分別提取各組細(xì)胞總RNA，合成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR，結(jié)果用相對定量法2-ΔΔCt計算，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞Syk表達(dá)量按100%計算。Real-time PCR結(jié)果顯示(表1)，與對照組相比，藥物組的mRNA表達(dá)量明顯增加，且該作用具有時間-濃度依賴性。

2.35-aza-CdR對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中Syk蛋白表達(dá)的影響

未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為對照組，經(jīng)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞作為處理組，GAPDH蛋白量作為內(nèi)參照。Western blot檢測結(jié)果見圖2。軟件分析結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)濃度分別為0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L的5-aza-2-CdR處理72 h后，Syk蛋白相對表達(dá)量分別為1.97±0.15(P<0.05)、2.37±0.24(P<0.01)和3.23±0.19(P<0.01)。

Tab.

RT-PCR was carried out to determine the relative expression of Syk mRNA after treatment with different concentration of 5-aza-2-CdR(0.1 μmol/L,1 μmol/L and 10 μmol/L)for 24 h,48 h and 72 h.mRNA of GAPDH was used as internal control

RT-PCR:Real-time PCR

**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 24 h;△P<0.05 vs 48 h

Fig.2Western blot analysis of Syk expression in Daoy cell line using the anti-sykmAb GAPDH was used as internal control

2.45-aza-CdR對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell侵襲和遷移是以穿過人工基底膜和聚酯碳酸膜的細(xì)胞數(shù)量表示細(xì)胞侵襲和運動能力的大小。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)不同濃度5-aza-2-CdR處理72 h的細(xì)胞，其侵襲和遷移能力均降低，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(表2)。

5-aza-2-CdRAvalueofinvasionAvalueofmigrationControl0.376±0.0150.493±0.0140.1μmol/L0.359±0.0130.474±0.0181.0μmol/L0.238±0.018*0.324±0.021*10μmol/L0.143±0.021**0.220±0.017**

*P<0.05,**P<0.01 vs control

3　討論

表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，這些改變包括抑癌基因的過甲基化、原癌基因的低甲基化以及基因印記丟失等。DNA的甲基化一直是表觀遺傳學(xué)研究的一個熱點，其在功能上與DNA突變一樣可導(dǎo)致基因功能缺失，但兩者的不同在于，DNA的甲基化修飾是可以被抑制的，如果能夠抑制其甲基化，那么原本因甲基化而沉默的基因?qū)匦卤磉_(dá)。而5-aza-CdR作為一種甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，是第一個被美國FDA批準(zhǔn)用于治療惡性腫瘤的去甲基化藥物，主要用于骨髓增生異常綜合征的治療[4]。一項體外實驗[5]顯示5-aza-CdR聯(lián)合DZNep、TSA共同作用于人AML細(xì)胞后表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同抗腫瘤的作用。這些都表明5-aza-CdR作為臨床抗腫瘤藥物有著較好的應(yīng)用前景。

Syk是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，最初被認(rèn)為是造血細(xì)胞特有的信號分子，并且在淋巴細(xì)胞成熟和免疫細(xì)胞活化中起著重要作用[2]。而隨后的研究表明，Syk與多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后都有密切關(guān)系[3]，從而引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。Sada[6]等研究發(fā)現(xiàn)，Syk的表達(dá)缺失會導(dǎo)致免疫細(xì)胞發(fā)育、成熟障礙，從而引起機(jī)體免疫監(jiān)測功能下降，對突變或異常增生的細(xì)胞失去免疫力，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Yuan[7]等研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中Syk基因啟動子區(qū)5’端CpG島的甲基化是其表達(dá)沉默的重要機(jī)制之一，而甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2-CdR可以使其重新表達(dá)。多項研究發(fā)現(xiàn)，Syk在多種惡性腫瘤中都發(fā)揮著抑癌基因的作用。如在結(jié)直腸癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]及胰腺癌[10]中,Syk抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移且與患者預(yù)后和生存率呈正相關(guān)性。

本研究以髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞為研究對象，旨在探討Syk在髓母細(xì)胞瘤中是否存在過甲基化現(xiàn)象及其與髓母細(xì)胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Syk基因在髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中存在啟動子區(qū)的過甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)水平明顯降低。用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2-CdR處理細(xì)胞后，Syk在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；同時，髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞的侵襲及遷移能力則明顯降低(P<0.05)。實驗結(jié)果表明Syk對髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞的侵襲及遷移能力有明顯的抑制作用，其作用的IC50值分別為7.7 μmol/L與8.5 μmol/L。Syk基因啟動子甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)可能在髓母細(xì)胞瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制中起著一定的作用。

Carter[11]等研究認(rèn)為，Syk是一個與癌基因HER2/neu的功能相反的抑癌基因，Syk通過抑制HER2/neu基因的收縮血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，來抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Layton[10]等研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中Syk表達(dá)缺失會導(dǎo)致CD171的表達(dá)上調(diào)，而CD171可以誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，并且能增強(qiáng)體外培養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。他們推測因Syk表達(dá)缺失而導(dǎo)致基因表達(dá)的“鏈?zhǔn)阶兓?，最終引起了腫瘤表型變化。張[12]等研究表明，5-aza-2-CdR可降低全基因組甲基化水平，這意味著原本由于甲基化而表達(dá)受抑制的某些癌基因也會因此而重新表達(dá)，因此如何尋找更具針對性的去甲基化藥物也是一個尚待解決的難題。目前為止，Syk基因的的具體作用及其所涉及的信號通路仍不清楚。Syk基因的表達(dá)缺失是多因素的，甲基化只是其機(jī)制之一，而且究竟是甲基化的發(fā)生促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還是腫瘤的形成引發(fā)了甲基化，這些問題都需要繼續(xù)深入的研究來解決。

本研究表明，在體外細(xì)胞水平，Syk在髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞中發(fā)揮著一定的抑癌基因的作用，主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而在臨床實體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中是否存在Syk基因啟動子的過甲基化和表達(dá)水平下調(diào)，及其作用如何，需進(jìn)一步研究以明確。

[1]Taylor MD,Northcott PA,Korshunov A,et al.Molecular subgroups of medulloblastoma:the current consensus[J].Acta Neuropathol,2012,123(4):465-472.

[2]Mócsai A,Ruland J,Tybulewicz VL.The SYK tyrosine kinase:a crucial player in diverse biological functions[J].Nat Rev Immunol,2010,10(6):387-402.

[3]Coopman PJ,Mueller SC.The Syk tyrosine kinase:a new negative regulator in tumor growth and progression[J].Cancer Lett,2006,241(2):159-173.

[4]Momparler RL,C?té S,Momparler LF,et al.Epigenetic therapy of acute myeloid leukemia using 5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)in combination with inhibitors of histone methylation and deacetylation[J].Clin Epigenetics,2014,6(1):19.

[5]Issa JP,Kantarjian HM,Kirkpatrick P.Azacitidine[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(4):275-276.

[6]Sada K,Takano T,Yanagi S,et al．Structure and function of Syk protein-tyrosine kinase[J].J Biochem,2001,130(2):177-186．

[7]Yuan Y,Mendez R,Sahin A,et al.Hypermethylation leads to silencing of the Syk gene in human breast cancer[J].Cancer Res,2001,61(14):5558-5561.

[8]Yang Z,Huo L,Chen H,et al.Hypermethylation and prognostic implication of Syk gene in human colorectal cancer[J].Med Oncol,2013,30(2):586-588.

[9]Peng C,Sun Q,Hao Y,et al.Syk is low-expressed in non-small-cell lung cancer and inversely correlates with patient's survival[J].Acta Biochim Biophys Sin,2013,45(2):149-151.

[10]Layton T,Stalens C,Gunderson F,et al.Syk tyrosine kinase acts as a pancreatic adenocarcinoma tumor suppressor by regulating cellular growth andinvasion[J].Am J Pathol,2009,175(6):2625-2636.

[11]Carter WB,Hoying JB,Boswell C,et al.HER2/neu over expression induces endothelial cell retraction[J].Int J Cancer,2001,91(3):295-299．

[12]張楹恬,田衛(wèi)平,梅玫.miR-21與DNA甲基化在不同乳腺癌細(xì)胞中的相互作用[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2015,31(3):220-224.

The relationship between hypermethylation of Syk gene promoter and medulloblastoma cell invasion and metastasis

JI Hai-long1,SHI Peng-fei1,ZHOU Jie2,MAO Tian-ming3,LUO Yong-kang3,CHEN Xi4,ZHOU Kai-yu1△

(1.The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000;2.Taizhou University Medical School,Taizhou 318000; 3.Department of Neurosurgery,Zhejiang Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000; 4.Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,China)

Objective:To investigate the effect of demethylation of Syk gene promoter by the methylation transferase inhibitor 5-aza-CdR on the invasion and metastasis of medulloblastoma cell line Daoy.Methods:Medulloblastoma cell line Daoy was treated with 5-aza-CdR in vitro.Methylation-specific PCR,real time-PCR and Western blot were used to detect Syk gene promoter methylation status,Syk mRNA and protein expression respectively.Transwell was employed to study the invasion and metastasis of medulloblastoma cell line Daoyby counting the cells that had invaded through Matrigel and migrated to the undersurface of the membrane before and after treatment of 5-aza-CdR.Results:In comparison to control group,Syk gene promoter of 5-aza-CdR-treated groups was demethylated and expression of Syk mRNA and protein was significantly up-regulated by 3.40±0.24 folds(P<0.01)and 3.23±0.19 folds(P<0.01)respectively.The invasiveness and metastasis of medulloblastoma cell line Daoy was decreased(P<0.05).Conclusion:Hypermethylation of Syk gene promoter is responsible for the down-regulation of Syk gene expression in medulloblastoma cell line Daoy,which may be one of the mechanisms that enhanced cell invasion and metastasis.While 5-aza-CdR can reverse the hypermethylation of Syk gene promoter and restore Syk gene expression and thus suppresses invasiveness and metastasis of tumor cells.

medulloblastoma;Syk gene;methylation;5-aza-CdR;invasion and metastasis

臺州市科技局科技計劃資助項目(14SF05)；浙江省中醫(yī)藥管理局科技計劃資助項目(2013ZA133,2015ZB133)

2015-11-02

2015-12-09

△Tel：13957680507；E-mail：kerry2000year@163.com

R-3

A

1000-6834(2016)02-132-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.010