沙愛龍

(西南醫(yī)科大學生理學教研室，四川 瀘州 646000)

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阿里紅黃酮對衰老模型小鼠的抗衰老作用*

沙愛龍△

(西南醫(yī)科大學生理學教研室，四川 瀘州 646000)

目的：研究阿里紅黃酮對衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法：將小鼠隨機分為6組(n=12)：正常對照組，衰老模型組，陽性對照組，低、中、高劑量阿里紅黃酮組。除正常對照組外，其余各組均采用D-半乳糖頸背部皮下注射建立亞急性衰老小鼠模型，用不同劑量的阿里紅黃酮(100、200和400 mg/(kg·d))灌服小鼠6周后，計算衰老模型小鼠腦指數及脾臟指數、胸腺指數，測定其腦組織丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、肝組織過氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果：阿里紅黃酮3個劑量組可不同程度的升高衰老模型小鼠的腦指數、脾臟指數、胸腺指數、腦組織中的GSH- Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性，降低其腦組織中的MDA含量。結論：阿里紅黃酮可能通過提高機體的抗氧化能力而達到抗衰老作用。

阿里紅黃酮；衰老模型小鼠；抗衰老；抗氧化酶

阿里紅(Fomes officinalis Ames)，又名苦白蹄，屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、層孔菌屬(Fomes)真菌，為落葉松病原菌，主要分布在我國西部和東北，其中新疆林區(qū)分布廣泛，尤以阿爾泰林區(qū)所產最為著名，容易采集。作為常用的維吾爾藥材，有溫胃祛痰、祛風除濕、消腫利尿之功用[1]，并且能增強體力和機體的應激能力。阿里紅含有黃酮、多糖、皂甙類和萜烯類等化學成分。近年來對阿里紅多糖藥理學研究已有報道，如依巴代提·托乎提等[2]通過阿里紅多糖對氧自由基的清除作用實驗研究表明：阿里紅多糖在體外可有效的清除O2-，可明顯減少小鼠心臟、肝臟、腎臟和脾臟中脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的含量；叢媛媛等[3]通過阿里紅多糖對小鼠免疫功能的影響得知阿里紅多糖有顯著的免疫增強作用；帕麗達·阿不力孜等[4]通過阿里紅多糖對衰老模型小鼠的抗衰老作用研究表明阿里紅多糖具有一定的抗衰老作用。黃酮亦為阿里紅主要有效成分之一，阿布來提·阿布都熱西提[5]用乙醇熱回流法對阿里紅中總黃酮進行了提取并測定其含量，結果表明阿里紅中黃酮含量為1.82 mg/g。目前，關于阿里紅黃酮藥理學方面的研究尚少有報道，本實驗擬用阿里紅黃酮作用于衰老模型小鼠，看其對小鼠是否具有抗衰老作用，以期為阿里紅的開發(fā)和利用提供新的理論基礎，也可為新藥的研發(fā)提供新思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物

昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，許可證號SCXK(新)2003-0001，由塔里木大學動物科學學院動物實驗站提供。

1.2藥品與儀器

阿里紅，采于新疆阿勒泰并經鑒定。D-半乳糖、Triton X-100(Sigma公司)，維生素E、H2O2(Fluka公司)，鉬酸銨(滬試)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。無水乙醇、丙酮、乙醚、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4及NaCl均為國產分析純。PowerWave XS全波長酶標儀(美國Bio-Tek寶特)，723型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，精密電子天平(上海精科天平)，電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)。

1.3阿里紅黃酮的制備

參照阿布來提·阿布都熱西提提取方法Ⅱ[5]制備：將陰干的阿里紅粉末，置于索氏提取器中，用75 %乙醇為溶劑連續(xù)提取6 h，最后進行減壓濃縮。經真空干燥箱60℃干燥，所得膠狀固體參照阿布來提·阿布都熱西提的鑒定方法[5]鑒定為阿里紅總黃酮。精密稱取阿里紅黃酮2.00 g，置100 ml容量瓶中，加蒸餾水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得400 mg/kg高劑量阿里紅黃酮(含阿里紅黃酮20 mg/ml)。后稀釋兩次，各稀釋一倍，得200 mg/kg 中劑量(含阿里紅黃酮10 mg/ml)和100 mg/kg低劑量(含阿里紅黃酮5 mg/ml)阿里紅黃酮。

同時配制1.5%的D-半乳糖溶液與0.25%的維生素E溶液(用植物油溶解)，分別裝入磨口瓶中，放人冰箱中冷藏備用。

1.4動物分組、衰老模型建立及給藥

72只小鼠，隨機分為6組，即正常對照組，衰老模型組，陽性對照組(維生素E)，低、中、高劑量阿里紅黃酮組(n=12)。除正常對照組外，其余各組300 mg/kg(1.5%的D-半乳糖溶液，按0.20 ml/10 g注射)每日頸背部皮下注射D-半乳糖，連續(xù)6周，建立小鼠衰老模型，正常組注射等量生理鹽水。造模同時每天分別灌胃(0.20 ml/10 g)給予低、中、高劑量阿里紅黃酮，陽性對照組每天給予維生素E 50 mg/(kg·d)(0.25%的維生素E溶液，按0.20 ml/10 g灌胃)，正常對照組、衰老模型組給予生理鹽水50 ml/kg。6周后，各組小鼠頸椎脫臼處死取全腦、胸腺、脾臟、肝臟，用4℃的生理鹽水沖洗2 次，濾紙拭干后，立即稱重，計算出腦及免疫器官指數。剪碎腦及肝組織塊，分別置于9倍的預冷生理鹽水中，冰水浴勻漿10 min，分別制成10%腦及肝臟組織勻漿，離心后取上清液待測。

1.5測定指標及方法

分別測定：腦組織勻漿中蛋白質、MDA含量及GSH-Px活性，肝組織勻漿中蛋白質含量及過氧化氫酶(catalase，CAT)、SOD活性。

CAT活性測定采用鉬酸銨比色法。

SOD、GSH-Px活性和蛋白質、MDA含量測定均按照所購買試劑盒說明書進行。

1.6統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1阿里紅黃酮對衰老模型小鼠腦及免疫器官指數的影響

與正常對照組相比，衰老模型組小鼠的腦指數及脾臟指數、胸腺指數均極顯著降低(P<0.01)。與衰老模型組相比，阿里紅黃酮3個劑量組腦指數及脾臟指數、胸腺指數均升高，其中3個劑量組的脾臟指數和中、高劑量組的腦指數、胸腺指數均極顯著高于衰老模型組(P<0.01)，低劑量組的腦指數、胸腺指數雖高于衰老模型組，但差異均不顯著。維生素E組(陽性對照)小鼠的腦指數及脾臟指數、胸腺指數均極顯著高于衰老模型組(P<0.01，表1)。

GroupCerebralSpleenThymusNormalcon-trol15.09±2.377.53±1.201.87±0.36Agingmodel10.85±1.03**3.08±0.44**0.64±0.10**VitaminE13.28±1.14##5.21±0.72##1.13±0.24##Lower11.46±1.694.66±0.69##0.86±0.20Intermediate12.87±0.75##5.27±0.75##1.29±0.28##High13.75±1.16##5.98±0.81##1.14±0.15##

**P<0.01 vs normal control;#P<0.05,##P<0.01 vs aging model

2.2阿里紅黃酮對衰老模型小鼠腦組織MDA、GSH-Px及肝組織CAT、SOD的影響

與正常對照組相比，衰老模型組小鼠腦組織中的MDA含量極顯著增加(P<0.01)，衰老模型組小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性均極顯著降低(P<0.01)。與衰老模型組相比，阿里紅黃酮3個劑量組小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性均升高，且都呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應的趨勢，其中高劑量組的腦組織GSH-Px活性和中、高劑量組的肝組織CAT、SOD活性均極顯著高于衰老模型組(P<0.01)，中劑量組的腦組織GSH-Px活性和低劑量組的肝組織CAT、SOD活性均顯著高于衰老模型組(P<0.05)，低劑量組的腦組織GSH-Px活性雖高于衰老模型組，但差異不顯著(P>0.05)。阿里紅黃酮3個劑量組和維生素E組(陽性對照)小鼠腦組織中的MDA含量均極顯著低于衰老模型組(P<0.01)。維生素E組(陽性對照)小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性均極顯著高于衰老模型組(P<0.01,表2)。

Tab.2　Effects of the Fomes officinalis flavonoids on the contents of MDA and the activities of GSH-Px in brain tissues,the activities of CAT and SOD in liver tissues of the aging model mice ±s，n=12)

MDA：Malondialdehyde；GSH-Px：Gutathione peroxidase；CAT：Catalase；SOD：Superoxide dismutase

3　討論

衰老是生命過程中正常而又復雜的生物過程，是諸多病理、生理過程綜合作用的結果，主要表現(xiàn)為生物體全身各組織、器官的退行性變化，從而使細胞變性、萎縮、數量減少、組織脫水以致大部分臟器重量減輕[6]。D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型是基于衰老的代謝學說而復制的一種衰老模型，是目前常用的制備衰老動物模型的方法[7,8]，其衰老反應接近或相當于自然衰老[9]。D-半乳糖是機體正常的營養(yǎng)成分，在一定時間內，連續(xù)給動物注射大劑量的D-半乳糖，機體細胞內的半乳糖濃度就會過多，這些半乳糖可由半乳糖氧化酶催化生成醛糖和過氧化氫，產生超氧陰離子損害正常組織細胞[10]。醛糖在醛糖還原酶的催化下，還原成不能被細胞進一步代謝的半乳糖醇，從而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹重要器官代謝障礙[11]，最終出現(xiàn)衰老。本實驗結果表明：衰老模型組小鼠的腦指數及脾臟指數、胸腺指數均極顯著低于正常對照組，腦及脾臟、胸腺顯著性萎縮說明本研究采用D-半乳糖造模成功；阿里紅黃酮3個劑量組可不同程度的升高衰老模型小鼠的腦指數及脾臟指數、胸腺指數，說明阿里紅黃酮能有效延緩小鼠腦及免疫器官的萎縮與退化、對抗衰老、促進機體代謝、提高機體免疫力。

脂質過氧化是氧自由基損傷組織的重要方式，MDA是脂質過氧化的主要產物之一，其在腦組織中的水平隨年齡的增加而升高，MDA含量的多少可間接反映自由基對機體的損傷程度[12]。GSH-Px、CAT、SOD是機體清除自由基的主要抗氧化酶，其含量可間接反映機體清除自由基的能力[13,14]。本實驗結果表明，阿里紅黃酮3個劑量組可不同程度的升高衰老模型小鼠腦組織中的GSH-Px活性及肝組織中的CAT、SOD活性，降低其腦組織中的MDA含量。這與鐘靈等[15]研究黃芪多糖對衰老模型小鼠血清中MDA含量、SOD活性及肝組織中GSH-Px活性、腦組織中CAT活性的影響結果相一致。本研究結果提示，阿里紅黃酮可減輕機體脂質過氧化損傷、提高抗氧化酶活性、增強自身抗氧化能力，從而發(fā)揮抗衰老作用。已有研究表明阿里紅多糖具有一定的抗衰老作用[4]，充分說明阿里紅中黃酮、多糖均為其抗衰老有效成分，但抗衰老作用機制有待于進一步研究。

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Effects of the Fomes officinalis flavonoids on anti-senile action in the aging model mice

SHA Ai-long△

(Department of Physiology,Southwest Medical University,Luzhou 646000,China)

Objective:To study the anti-senile effects of the Fomes officinalis flavonoids on the aging model mice.Methods:All Kun ming mice were randomly divided into six groups,and each group consisted of 12 animals.The groups were categorized as normal,model,positive control groups and low(100 mg/(kg·d)),medium(200 mg/(kg·d)),high(400 mg/(kg·d))doses of Fomes officinalis flavonoids treated groups.The study was carried out to investigate the cerebral index,spleen index,thymus index,the contents of malondi-aldehyde(MDA)and the activities of glutathione peroxidase(GSH-Px)in brain tissues as well as the activities of catalase(CAT)and superoxide dismutase(SOD)in liver tissues of the aging model mice treated with D-galactose in vivo by subcutaneous injection together with the Fomes officinalis flavonoids at doses of 100,200 and 400 mg/(kg·d)for 6 weeks.The normal group was administered with 0.20 ml/10 g of normal saline s.c.and 50 ml/kg of normal saline i.g.daily.Results:Compared with the aging model groups,the three doses of the Fomes officinalis flavonoids could elevate the cerebral index,spleen index,thymus index,activities of GSH-Px in brain tissues,the activities of CAT and SOD in liver tissues to different degree and decrease the contents of MDA.Conclusion:The Fomes officinalis flavonoids might have anti-senile action by improving antioxidant capacity of human body.

Fomes officinalis flavonoids;aging model mice;anti-senile;antioxidase

瀘州醫(yī)學院人才引進科研啟動金(2014YJRC04)；塔里木大學校長基金自然科學項目(TDZKSS201304)

2015-01-26

2015-10-13

△Tel：0830-3167057；E-mail:lyshaailong@163.com

R285.5

A

1000-6834(2016)02-121-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.007