陳　歡， 林　芳， 楊振華， 徐文微， 王　東， 劉東春△， 唐　星

(1. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 2. 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 3. 藥學(xué)院， 遼寧 沈陽 110016)

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水飛薊賓·熊去氧膽酸蒸發(fā)共沉淀物對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護作用*

陳歡1， 林芳2， 楊振華1， 徐文微1， 王東1， 劉東春1△， 唐星3

(1. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 2. 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 3. 藥學(xué)院， 遼寧 沈陽 110016)

目的：研究水飛薊賓·熊去氧膽酸蒸發(fā)共沉淀物(SUE)對小鼠CCl4致急性肝損傷的保護作用。方法：健康昆明種雄性小鼠80只，隨機分為8組(n=10)：空白組及模型組分別經(jīng)口投予羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，其余60只采用CCl4腹腔注射建立小鼠急性肝損傷模型，分別給予水飛薊賓(SLB，20 mg/kg)、熊去氧膽酸(UDCA，16.25 mg/kg)、SLB與UDCA等摩爾物理混合物(PM，36.25 mg/kg)和高中低劑量SUE(以SLB計10、20、40 mg/kg)治療，采用單因素方差分析肝體比變化，多功能酶標儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。結(jié)果：與空白組相比，模型組肝體比有顯著性升高(P<0.05)，血清中AST和ALT水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比SLB、PM、SUE組血清AST、ALT顯示有不同程度的下降(P<0.05)，但UDCA組無顯著性差異；與SLB和PM相比，SUE能明顯降低小鼠血清ALT、AST含量(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：SUE對CCl4所致小鼠急性肝損傷有較好的保護作用，說明LB與UDCA制備成共沉淀物后，可更好的發(fā)揮協(xié)同作用，提高聯(lián)合應(yīng)用的藥效。

水飛薊賓；熊去氧膽酸；共沉淀物；四氯化碳；保肝；小鼠

水飛薊賓(silybin，SLB)是從菊科植物水飛薊(SilybummarianumL. Gaertn)的種子中提取分離得到的一對兒黃酮木脂素類化合物，被廣泛應(yīng)用于治療肝炎、肝硬化和毒性肝損傷等疾病，其保肝機制為抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化、抗纖維化、細胞膜穩(wěn)定作用和調(diào)節(jié)肝細胞再生能力等[1-3]。但是SLB為一種難溶性的細小晶體，生物利用度不高，影響其藥效的發(fā)揮。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是中藥熊膽的有效成分，是一種非細胞毒性的膽汁酸，臨床主要用于治療慢性肝炎和原發(fā)性膽汁淤積性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎等各種膽汁淤積性肝病[4,5]。有臨床試驗表明，SLB和UDCA聯(lián)合應(yīng)用治療非酒精性脂肪肝較單用SLB有較好療效[6]，將SLB和UDCA制備成蒸發(fā)共沉淀物(silybin-ursodeoxycholic acid evaporated coprecipitate，SUE)，可以提高SLB的體外溶出及生物利用度[7]。為了進一步驗證SUE的肝臟保護作用，本研究采用CCl4制造小鼠急性肝損傷模型，觀察SUE對實驗性肝損傷的保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

Synergy HT 型多功能酶標儀(BioTek基因有限公司)，J2-HS型低溫離心機(Beckman公司)，JJ500型電子天平(常熟市雙節(jié)測試儀器廠)。SLB原料藥(遼寧盤錦華成制藥有限公司，批號20130301)，UDCA原料藥(武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司，批號20100510)，SLB與UDCA等摩爾物理混合物(Physical Mixture, PM)，SUE(自制，批號20140311)，CCl4(分析純，批號20140223，天津博迪化工有限公司)，門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)(批號20141212、20141215，南京建成生物工程研究所)。

1.2實驗方法及動物分組

SUE的制備[7]：將等摩爾的SLB與UDCA完全溶解于適量的無水乙醇，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑至干，必要時進一步減壓干燥至無醇味，粉碎過80目篩即得。

取健康昆明種雄性小鼠80只，由沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：211002300004781。隨機分為8組(n=10)，給藥組分別灌胃給藥SLB(20 mg/kg)，UDCA(16.25 mg/kg)，PM(以SLB計為20 mg/kg)，SUE(以SLB計為10、20、40 mg/kg，SUE-10，SUE-20，SUE-40)，灌胃藥物用0.3%(w/w)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)混懸均勻，配制相應(yīng)濃度，按20 mg/kg藥液體積灌胃，空白組和模型組均灌胃給予相應(yīng)體積的0.3%的CMC-Na水溶液，每日1次，連續(xù)2 d，第2次給藥(即實驗開始后24 h)0.5 h后，除空白組外，其他各組分別腹腔注射0.2% CCl4大豆油溶液，空白組腹腔注射大豆油，注射體積為10 ml/kg，5 h后第三次給藥，同時禁食不禁水。末次給藥11 h后各組小鼠稱重，摘眼球取血，分離血清冰盒保存待測；并解剖小鼠，分離完整肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱量肝臟重量并記錄。

1.3小鼠體重變化和肝體比計算

將小鼠實驗期間體重變化作圖，比較各組小鼠體重變化差異； 根據(jù)末次體重和小鼠肝臟重量計算肝體比(肝臟重量/體重)。

1.4AST和ALT指標檢測

血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)含量的測定按照試劑盒說明書操作，采用多功能酶標儀檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1對小鼠體重和肝體比的影響

各組小鼠在實驗期間體重未見明顯差異。與空白組相比，模型組動物肝體比顯著升高(P<0.05)，提示肝臟因為CCl4毒性導(dǎo)致急性炎癥性腫大；與模型組相比，其余各組肝體比無顯著性變化(圖1)。

SLB：Silybin； UDCA：Ursodeoxycholic acid； PM：Physical mixture of SLB and UDCA with equimolar ratio; SUE：SLB·UDCA evaporated coprecipitate

*P<0.05vscontrol group

2.2對小鼠血清中AST及ALT的影響

與control組相比，model組中血清AST與ALT水平均顯著升高(P<0.01)。與model組相比，UDCA組AST與ALT都沒有顯著性變化，SLB組和PM組僅AST水平顯著性降低(P<0.05)，ALT水平?jīng)]有顯著性變化；SUE各劑量組AST和ALT水平有顯著性降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性，其中以高劑量作用最為明顯。與SLB組相比，PM組AST和ALT水平無顯著性差異；SUE中、高劑量組血清的AST與ALT水平均顯著性降低(P<0.05，P<0.01)；SUE低劑量組(10 mg/kg)的ALT水平顯著低于SLB組(20 mg/kg)(P<0.01)；與PM組相比，SUE-40組AST和ALT水平顯著性降低(P<0.05)；SUE-20組ALT水平有顯著性降低(P<0.05)，AST水平有降低趨勢，但無顯著性差異(圖2)。

3　討論

各組小鼠實驗期間體重未見明顯差異，原因可能是實驗時間較短，小鼠體重差異未完全顯現(xiàn)；另外取血前各組小鼠體重均有下降趨勢，原因是末次給藥后小鼠禁食，導(dǎo)致體重略微下降[8]。

通過對各組小鼠肝體比進行比較，model組小鼠較空白組小鼠肝體比顯著性升高，原因是CCl4毒性刺激使小鼠肝臟細胞腫脹變性導(dǎo)致小鼠肝重增加，提示造模成功[9]。而各給藥治療組與model組相比，沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，可能與實驗時間較短，各受試藥物未能完全逆轉(zhuǎn)細胞損傷有關(guān)。

SLB：Silybin； UDCA：Ursodeoxycholic acid； PM：Physical mixture of SLB and UDCA with equimolar ratio； SUE：SLB·UDCA evaporated coprecipitate； AST：Aspartate aminotransferase； ALT：Alanine aminotransferase

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsSLB group;?▲▲P<0.01vsPM group

CCl4肝損傷模型是研究化學(xué)性肝損傷的經(jīng)典模型。CCl4進入機體后，經(jīng)肝臟細胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(CCl3)和三氯甲基過氧自由基(OOCCl3)，這兩種自由基導(dǎo)致肝細胞脂質(zhì)過氧化或壞死，引起細胞膜通透性改變和線粒體損傷，引起肝細胞的各種變化導(dǎo)致肝損傷，致使正常分布在肝組織內(nèi)的AST和ALT滲漏，主要表現(xiàn)為血清中轉(zhuǎn)氨酶活性增加[10-14]。SLB是一種抗氧自由基活性物質(zhì)，其能減少CCl4的代謝激活生成的自由基并對這些自由基有清除作用，有研究證明，SLB能使CCl4對脂質(zhì)的共價結(jié)合明顯減少[13,14]。

本研究結(jié)果表明，SLB以及PM與model組相比表現(xiàn)出血清中AST水平下降，但對血清中ALT活性沒有明顯作用，原因可能是該給藥劑量的SLB對ALT活性的降低作用不如對AST敏感，有類似研究也顯示出相同結(jié)果[10]；而UDCA對AST和ALT活性降低作用不顯著，可能是因為UDCA自身缺少還原基團，UDCA體內(nèi)抗氧化作用可以通過增加肝細胞中谷胱甘肽和含硫醇蛋白的水平等作用實現(xiàn)的，機制復(fù)雜且緩慢，而在本試驗時間較短所以未表現(xiàn)出降低血清中轉(zhuǎn)氨酶的作用[15-17]。與SLB組相比，PM組在降低血清中AST和ALT活性方面沒有顯著性差異，因而提示僅通過簡單物理混合使用SLB和UDCA不能很好的發(fā)揮二者的協(xié)同作用。

SUE組與SLB組相比可顯著改善CCl4致小鼠肝臟損傷，甚至較低劑量的SUE-10降酶水平也好于SLB單獨給藥；此外，SUE-40和SUE-20組與PM組比較，顯著降低血清AST和ALT水平，表現(xiàn)出較好的保肝效果，推測主要是因為將SLB與UDCA制備成共沉淀物后可顯著加快SLB的溶出速率，提高其在機體內(nèi)的生物利用度[7]，因此可以達到良好的保肝效果。UDCA是否能提高SLB對肝臟的靶向性，以及二者在作用靶點及通路上是否有保肝的協(xié)同作用有待進一步深入研究。

總之，將SLB和UDCA制備成共沉淀物SUE，可顯著提高藥效，為SLB與UDCA的聯(lián)合用藥提供了一種新的制劑形式。

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silybin;ursodeoxycholic acid;coprecipitate;CCl4;hepatoprotective;mice

2015-04-27

2015-10-12

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R96

A

1000-6834(2016)01-038-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.010