尚　宇，薛　強(qiáng)，顧佩菲，李　悅，高光潔△

(1.解放軍第四六三醫(yī)院麻醉科,遼寧 沈陽 110042；2.東北制藥集團(tuán)市場部,遼寧 沈陽 110016；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬一院麻醉科,黑龍江 哈爾濱 150001)

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右美托咪定對腦缺血/再灌注大鼠海馬興奮性氨基酸含量及NMDA受體亞單位NR1表達(dá)的影響*

尚宇1，薛強(qiáng)1，顧佩菲2，李悅3，高光潔1△

(1.解放軍第四六三醫(yī)院麻醉科,遼寧 沈陽 110042；2.東北制藥集團(tuán)市場部,遼寧 沈陽 110016；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬一院麻醉科,黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：觀察右美托咪定預(yù)處理對全腦缺血/再灌注大鼠海馬細(xì)胞外谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)含量及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體1(NR1)表達(dá)的影響，探討右美托咪定腦保護(hù)作用及其神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)制。方法：雄性Wistar大鼠54只，隨機(jī)分為3組(n=18)：假手術(shù)組、腦缺血/再灌注組和右美托咪定預(yù)處理組。用四血管閉塞法建立大鼠全腦缺血模型。收集清醒、缺血15 min及再灌注0～1 h微透析標(biāo)本。于全腦缺血15 min再灌注1 h后，迅速斷頭取腦，采用免疫組化法和蛋白免疫印跡法檢測海馬NMDA受體NR1亞單位的表達(dá)情況。結(jié)果：與腦缺血/再灌注組相應(yīng)時點(diǎn)比較，右美托咪定預(yù)處理組大鼠海馬微透析液中Glu、Asp含量明顯降低(P<0.05,0.01)；免疫組化和Western-blot法檢測顯示右美托咪定預(yù)處理組大鼠海馬組織NMDA受體亞單位NR1表達(dá)明顯受抑制(P<0.05,0.01)。結(jié)論：右美托咪定預(yù)處理不僅減少腦缺血/再灌注時興奮性氨基酸釋放，還能抑制NMDA受體亞單位NR1的高表達(dá)而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

右美托咪定；缺血/再灌注損傷；谷氨酸；天門冬氨酸；NMDA受體；大鼠

缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病，其致殘率和死亡率均高，嚴(yán)重影響著人類的身體健康和生活質(zhì)量。當(dāng)腦缺血缺氧后，神經(jīng)元釋放大量以谷氨酸(glutamate,Glu)為代表的興奮性氨基酸(excitatory amino acids,EAA)通過激活其N-甲基-D-天冬氨酸(N-methy1-D-aspartate,NMDA)受體(NR1是其主要功能亞單位)而引起神經(jīng)元的缺血缺氧性損傷[1]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種新型的高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，因其對大腦和神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用而逐漸受到重視，但其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的確切機(jī)制尚不完全清楚。本實驗以“四血管阻斷”全腦缺血大鼠為研究對象，利用腦微透析技術(shù)結(jié)合免疫印跡和免疫組化法動態(tài)觀察右美托咪定對腦缺血/再灌注早期大鼠海馬細(xì)胞外谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)含量及NMDA受體亞單位NR1表達(dá)的影響，旨在探討右美托咪定預(yù)處理的腦保護(hù)作用及其神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

CK-2倒置顯微鏡( 日本Olympus公司)；Metamorph 顯微圖像分析系統(tǒng)( 美國、日本聯(lián)合生產(chǎn))；Cryotome E冷凍切片機(jī)(英國Shan Don公司)；江灣I 型C 大鼠腦立體定位儀( 第一軍醫(yī)大學(xué))；微透析針(瑞典)；高壓液相儀和AccQ.Tag試劑盒(美國，Waters公司)；谷氨酸，天門冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號050725，每支200 μg)；NR1免疫組織化學(xué)染色試劑盒、兔源抗-NR1抗體、兔抗β-actin抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠(Novex，San Diego，美國 CA)；Western-blot熒光試劑Ecl(美國，Saniacruz公司)；RIPA裂解液和BCA試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2實驗動物與分組

成年Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量(225±50)g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供[實驗動物合格證號：SYXK(軍)2012-0001]。隨機(jī)分成3組(n=18)：(1)假手術(shù)組(Sham組)：僅暴露雙側(cè)翼小孔雙側(cè)頸總動脈，不行阻閉；(2)全腦缺血/再灌注組(the total cerebral ischemia,TCI組)；(3)右美托咪定預(yù)處理組(DEX組)。采用“四血管阻斷法”建立模型成功的大鼠36只隨機(jī)編入TCI組和DEX組。給藥方法：DEX組于全腦缺血前60 min經(jīng)尾靜脈泵注5 μg·kg-1·h-1右美托咪定預(yù)處理60 min；Sham組和TCI組于全腦缺血前60 min泵注生理鹽水60 min，輸注速度2 ml/h。

1.3全腦缺血/再灌注模型的建立

TCI組和DEX組大鼠經(jīng)乙醚麻醉后俯臥位固定鼠板上，維持大鼠肛溫在(37.0±0.5)℃。采用Pulsinelli-Brierley的方法[2]，大鼠頸背側(cè)切口，剝離肌肉暴露第一頸椎上雙側(cè)翼孔，熱凝閉塞從中走行的椎動脈，造成永久性閉塞，縫合切口，置保溫鼠籠。手術(shù)24 h后，乙醚麻醉仰臥固定大鼠，頸前切口顯露雙側(cè)頸總動脈，夾閉雙側(cè)頸總動脈30 s后描記腦電波判斷模型是否成功(腦電變成直線作為模型成功標(biāo)準(zhǔn))。夾閉15 min后松開動脈夾行再灌注60 min。Sham組大鼠僅暴露雙側(cè)翼孔和頸總動脈，不行阻閉。

1.4海馬微管透析

Wistar大鼠乙醚麻醉后，顱平位固定于大鼠腦立體定位儀上。參照Paxions&Watson大鼠腦圖譜定位：A-5.8 mm，V-8.0 mm，L-4.8 mm，切開頭皮，鉆孔，直徑4 mm。微透析探針(CMA/10，瑞典，透析膜內(nèi)徑0.05 mm，長度為1 mm，能通過分子量最大為20 kD)插入背側(cè)海馬(CAI)。將大鼠腦內(nèi)透析管與微量透析泵相連，用灌流液(Ringer’s：NaCl 150 mmol/L，KCl 3.0 mmol/L，CaCl21.7 mmol/L，MgCl20.9 mmol/L)以2 μl/min速度灌流，收集樣品，高壓液相儀分析測定Glu和Asp含量。實驗結(jié)束后檢查透析管埋植的位置，取透析管在海馬的樣本作為有效數(shù)據(jù)。

1.5谷氨酸(Glu)和天門冬氨酸(Asp)測定

將收集的微透析標(biāo)本用Savant濃縮干燥儀干燥、AccQ.Tag衍生、上樣，用高壓液相儀(3.9×150 m氨基酸分析柱，Waters996二極管陣列檢測器，Waters2690泵)分析樣本Glu和Asp的含量。

1.6免疫組化方法檢測NR1亞基的表達(dá)

再灌注60 min后，每組抽取6只大鼠行心內(nèi)快速灌注4%多聚甲醛(0.1 mol·L-1磷酸緩沖液，4℃)固定30 min，斷頭取腦置固定液中后固定8 h，然后用20%、30%的蔗糖磷酸緩沖液浸至沉底。Cryotome E恒冷切片機(jī)行腦連續(xù)冠狀切片，片厚為30 μm，至所需部位(腦前囟后3～3.5 mm)，每隔三取一，連續(xù)留存5片，取相鄰3套切片，分別行NR1免疫組化染色，陰性對照及HE染色。主要步驟：切片后依次加入3%過氧化氫甲醇溶液室溫30 min；正常山羊血清37℃ 30 min；兔抗NR1多克隆抗體置濕盒4℃過夜；生物素標(biāo)記的二抗37℃ 30 min；鏈酶親和素過氧化物酶37℃ 30 min；然后滴加新鮮配制的DAB顯色5～10 min。Metamorph 顯微圖像分析儀對切片進(jìn)行圖像分析測量海馬CA1區(qū)：(1)積分光密度；(2)陽性細(xì)胞面積；(3)灰度值，每只大鼠測5張切片，取平均值。

1.7蛋白印跡技術(shù)(Western-blot)檢測NR1亞基的表達(dá)

腦缺血/再灌注1 h后，每組抽取6只大鼠斷頭取海馬組織碾碎(整個過程需在冰上操作)，置入4℃裂解緩沖液中，勻漿、離心取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品加熱、變性。以每孔20 μg總蛋白上樣后，SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜，膜封閉2 h，加一抗( 兔源抗-NR1抗體或兔源抗-β-actin抗體)；加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)，室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行曝光、顯影及圖像采集；每步驟間TBST洗滌(5 min×3次)，以NR1蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白光密度的比值表示NR1蛋白的相對含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1腦缺血/再灌注不同時點(diǎn)大鼠海馬微透析液中EAA含量的變化

大鼠海馬微透析液中EAA含量在腦缺血15 min時點(diǎn)達(dá)高峰，隨著腦血流恢復(fù)再灌注開始(0～1 h時)海馬細(xì)胞外EAA含量開始逐漸降低。與Sham組相應(yīng)時點(diǎn)比較，TCI組和DEX組大鼠海馬微透析液中的Glu、ASP含量明顯增高，具有顯著性差異(P<0.05,0.01,圖1、圖2)；除再灌注(45～60 min)時點(diǎn)外，DEX組在相應(yīng)時點(diǎn)與TCI組相比較Glu、ASP含量明顯降低，有顯著性差異(P<0.05,圖1、圖2)。

DEX:Dexmedetomidine;Glu:Glutamate

*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs TCI group

2.2NMDA受體NR1亞基免疫組化檢測

與Sham組比較，TCI組和DEX組大鼠海馬CA1區(qū)NR1光密度、陽性細(xì)胞面積、灰度值均具有顯著性差異(P<0.05,0.01,表1，圖3)。與TCI組比較，預(yù)注DEX能明顯下調(diào)海馬CA1區(qū)NR1蛋白表達(dá)的各項指標(biāo)，具有顯著性差異(P<0.05,0.01,表1，圖3)。

*P<0.05，**P<0.01 vs Sham group；#P<0.05 vs TCI group

GroupIntegratedODPositivecellularareaAveragegreyvalueSham4215.4±305.761536.7±3458.7215.8±18.7TCI11754.3±1004.4**91245.3±8014.3**99.8±8.5*DEX6851.7±421.7*##70004.0±4241.5*#128.9±10.5*##

*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05#，##P<0.01 vs TCI group

Fig.3NR1 expression in hippocampus CA1 in different group(×400)

A:Sham group;B:Total cerebral ischemia(TCI)group;C:Dexmedetomidine group

2.3NMDA受體NR1亞基Western-blot檢測

與Sham組比較，TCI組和DEX組大鼠海馬NR1表達(dá)水平明顯增高(P<0.01,圖4)；與TCI組比較，經(jīng)DEX預(yù)處理后的大鼠海馬NR1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,圖4)。

Fig.4NR1 protein expression by Western blot analysis in different group

3　討論

缺血性腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，其中興奮性氨基酸(excitatory amino acid，EAAs )毒性是腦缺血致神經(jīng)元損傷的重要觸發(fā)物和介導(dǎo)者。EAAs主要是指Glu和Asp。正常情況下，EAAs的釋放、攝取和重吸收保持動態(tài)平衡。當(dāng)腦缺血缺氧損傷時，腦內(nèi)產(chǎn)生大量的EAAs，作用其受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載及一系列的變化，最終使神經(jīng)細(xì)胞代謝衰竭而死亡。EAA升高的程度與腦損傷的程度有關(guān)，損傷越嚴(yán)重則EAA升高越顯著，持續(xù)時間越長[3]。

缺血性腦損傷中神經(jīng)細(xì)胞的死亡與N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)活性的改變密切相關(guān)。其中 NMDA受體1(NR1)作為一種特異性離子型受體，是介導(dǎo)神經(jīng)毒性最主要的受體之一。腦缺血時，隨著海馬等腦區(qū)細(xì)胞外Glu大量釋放，刺激NR1過度興奮，Ca2+大量內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等一系列病理反應(yīng)，最終引起神經(jīng)元興奮毒性、潰變，直至死亡。如能阻斷Glu的合成和釋放、拮抗NR1亞基活性，減少Ca2+的內(nèi)流，就能有效地防止NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[4]。所以，檢測NR1的蛋白表達(dá)，能準(zhǔn)確評估右美托咪定預(yù)處理后對神經(jīng)元的保護(hù)作用、療效及其神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)制。

本室前期工作已經(jīng)驗證右美托咪定預(yù)處理后能夠抑制腦缺血/再灌注大鼠齒狀回星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的高表達(dá)，減緩腦缺血時星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，維持其增生狀態(tài)，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，參與腦缺血損傷后神經(jīng)功能保護(hù)作用[5]。本實驗在此基礎(chǔ)上，采用腦微透析技術(shù)結(jié)合免疫組化和蛋白印跡法觀察腦缺血/再灌注早期興奮性神經(jīng)遞質(zhì)及其受體變化，進(jìn)一步驗證右美托咪定預(yù)先給藥能否通過此途徑產(chǎn)生腦保護(hù)作用？結(jié)果顯示：在腦缺血15 min/再灌注0～1 h，右美托咪定預(yù)處理組各時間點(diǎn)的Glu、Asp含量及NMDAR1的表達(dá)均低于腦缺血/再灌注組，提示右美托咪定預(yù)先給藥能對抗腦缺血/再灌注后EAAs過度釋放及NMDAR1的表達(dá)，減輕EAAs過量生成和NMDAR1的高表達(dá)而導(dǎo)致的腦繼發(fā)性損害，其機(jī)制可能是通過以下途徑實現(xiàn)：(1)腦缺血時，右美托咪定通過抑制兒茶酚胺釋放，降低神經(jīng)元對EAAs的敏感性，改善毒性效應(yīng)；同時，右美托咪定激活突觸前膜G0或Gi蛋白耦聯(lián)的α2-腎上腺素能受體(α2-AR)，抑制Ca2+通道開放，促進(jìn)外向型K+通道開放，從而降低胞內(nèi)Ca2+濃度阻止神經(jīng)遞質(zhì)囊泡的破裂，抑制EAAs的釋放[6]；(2)腦缺血性再灌注后，預(yù)注右美托咪定后激活α2-AR促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對Glu的攝取和降解，抑制腎上腺素β受體的活性，降低神經(jīng)元的代謝率[7,8]；同時，星型膠質(zhì)細(xì)胞存在著谷氨酰胺合成酶，缺血性腦損傷該酶增加，能使谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，右美托咪定可以激活谷氨酰胺酶活性，提高星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化代謝Glu的能力，激活大腦皮層神經(jīng)末梢α2-AR、抑制電壓門控性Ca2+通道，進(jìn)而抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，減輕其興奮毒性[9]；(3)兒茶酚胺通過激活α2腎上腺素受體可加重神經(jīng)缺血性損傷，還可提高神經(jīng)元對EAAs的敏感性，加重缺血時Glu、Asp等神經(jīng)遞質(zhì)的興奮性毒性。右美托咪定通過抑制兒茶酚胺釋放，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)腦氧供需平衡，降低興奮性毒性、改善毒性效應(yīng)或提高缺血區(qū)域灌注產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[10]；(4)腦缺血后，細(xì)胞外谷氨酸蓄積，刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度興奮，引起細(xì)胞骨架破壞，右美托咪啶通過氧化還原機(jī)制增加了腦內(nèi)谷氨酰胺在星狀神經(jīng)細(xì)胞中的代謝，減少其作為EAAs前體的活性，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)的興奮性[11]。

綜上所述，右美托咪定不僅在神經(jīng)外科手術(shù)中，可以滿足鎮(zhèn)靜、穩(wěn)定血流動力學(xué)和減少腦血流等要求，而且在缺血/再灌注時也可以減少腦組織的損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。但其在腦保護(hù)作用中的劑量、使用方法及其腦保護(hù)機(jī)制等還有待進(jìn)一步深入研究，以期更有效地應(yīng)用于臨床。

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Effect of dexmedetomidine on the changes of EAA and the expression of NMDA NR1 protein in hippocampus in global cerebral ischemia/reperfusion rats

SHANG Yu1,XUE Qiang1,GU Pei-fei2,Li Yue3,GAO Guang-jie1△

(1.No.463 Hospital of PLA,Shenyang 110042;2.Northeast Pharmaceutical Group,Shenyang 110016; 3.The First-Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

Objective:To observe the effects of dexmedetomidine(DEX)on glutamate(Glu),aspartic acid(Asp)release and NMDAR1 expression in hippocampus in global cerebral ischemia/reperfusion rats,and investigate the protective effect and the related mechanism of neurotransmitters.Methods:Fifty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups(n=18):sham group(A),ischemia/reperfusion group(B),dexmedetomidine pretreatment group(C).Total cerebral ischemia model was set up by four vessel occlusion in rats.Glu and Asp levels were measured with microdialysis at different time.Then the animals were decapitated and the brains were immediately removed to detect NMDAR1 expression in hippocampus area by immunohistochemistry and Western-blot.Results:Compared with that in group B,the levels of Glu ,Asp and NMDA NR1 protein were significantly decreased in the dexmedetomidine pretreatment group(P<0.05 or 0.01).Conclusion:Dexmedetomidine might has a protective effect on hippocampus in global cerebral ischemia/reperfusion animals.The protective mechanism might be involved in inhibiting excitatory amino acids(EAA)release and NMDAR1 expression.

dexmedetomidine;ischemia/reperfusion injury;glutamate;aspartic acid;N-methyl-D-aspartate receptor;rat

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2015020416)

2015-09-06

2016-01-25

△Tel:024-28845351；E-mail:guangjie420@126.com

R363

A

1000-6834(2016)02-158-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.016