賈寧,孫欽儒,蘇倩

(1 西安交通大學醫(yī)學部，西安710061；2西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院)

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產(chǎn)前應激孕鼠子代抑郁樣行為觀察及機制探討

賈寧1,孫欽儒1,蘇倩2

(1 西安交通大學醫(yī)學部，西安710061；2西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院)

目的觀察產(chǎn)前應激孕鼠子代鼠的抑郁樣行為，并探討產(chǎn)前應激導致子代鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的作用機制。方法將孕鼠20只隨機分觀察組和對照組各10只。妊娠第14天(孕鼠進入孕晚期)起對觀察組給予束縛應激，45 min/次，3次/d，共束縛7 d。對照組孕鼠孕期不做任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。兩組子代鼠出生30 d時各取20只(雌雄對半)，進行糖水偏愛試驗，計算兩組雌、雄性子代鼠1%糖水消耗比(1%糖水消耗比表示抑郁性行為嚴重程度)；隨之將試驗后子代鼠斷頭處死，采用液相色譜串聯(lián)質譜分析法檢測兩組子代鼠海馬組織谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)和5-羥色胺(5-HT)。結果觀察組雌、雄性子代鼠1%糖水消耗比分別為63.13±3.47和59.67±3.33，對照組分別為79.22±7.07和78.67±4.72；觀察組雌、雄性子代鼠1%糖水消耗比與對照組相比，P均<0.05。觀察組雌、雄子代鼠海馬組織Glu的相對含量分別為(24.30±1.00)、(31.22±1.57)ng/g，對照組分別為(21.20±0.90)、(24.01±0.28)ng/g，觀察組雌、雄性子代鼠海馬組織Glu的相對含量與對照組相比，P均<0.05；觀察組雌、雄子代鼠海馬組織GABA的相對含量分別為(7.42±0.36)、(8.35±0.39)ng/g，對照組分別為(13.28±0.38)、(9.94±0.30)ng/g，觀察組雌、雄性子代鼠海馬組織GABA的相對含量與對照組相比，P均<0.05；觀察組雌、雄子代鼠海馬組織5-HT的相對含量分別為(0.27±0.02)、(0.26±0.01)ng/g,對照組分別為(0.35±0.03)、(0.29±0.02)ng/g，觀察組雌性子代大鼠海馬組織5-HT的相對含量與對照組相比，P<0.05。結論產(chǎn)前應激可導致子代鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，其機制可能與產(chǎn)前應激升高子代鼠海馬組織Glu含量及降低GABA、5-HT的水平有關。

產(chǎn)前應激；抑郁樣行為；海馬；谷氨酸；γ-氨基丁酸；5-羥色胺;動物實驗

產(chǎn)前應激(PS)是孕期母體受到各種內(nèi)外界環(huán)境因素、社會和心理因素刺激時，所表現(xiàn)出的全身性非特異性適應反應，可導致子代出現(xiàn)抑郁、焦慮等情感性精神障礙(MD)[1,2]。抑郁癥致殘占所有疾病致殘的40.5%[3]。5-羥色胺(5-HT)等單胺系統(tǒng)功能不足被認為是抑郁癥的發(fā)病原因，但近期研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)等非單胺類遞質及其受體在MD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4,5]。2014年1月～2016年2月，我們觀察了PS孕鼠子代鼠的抑郁樣行為，并探討PS導致子代鼠抑郁樣行為的機制?，F(xiàn)將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器妊娠SD大鼠20只[晚上9：00將20只成年雌性大鼠(體質量260～280 g)與7只成年雄性大鼠(體質量280～350 g)按3∶1合籠，次日早上8：00進行陰道涂片檢查，精子陽性定為妊娠第0天],單籠喂養(yǎng),飼養(yǎng)于22 ℃、60%濕度、12 h光/暗循環(huán)的動物房中，自由飲水、飲食。大鼠均由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。標準品Glu、GABA和5-HT均購自美國Sigma 公司；甲醇、乙腈為色譜級，水為超純水，其余試劑均為分析純。取Glu、GABA和5-HT標準品各5 mg，分別用含0.2%甲酸的甲醇-水(v/v=1∶1，以下同)溶液充分溶解配制成1 g/L的標準品儲備液。取100 μL的Glu、GABA和5-HT標準品儲備液，加入0.2%甲酸至1 mL?；靹蚝笾瞥?×105μg/L的混合標準品溶液，在對此混合標準品溶液進行稀釋，制備成500、100、50、10、5、1、0.5、0.1 μg/L的混合標準品溶液，冰上放置備用。超高效液相色譜儀Nexera LC-20ADXR、SIL-20AXR自動進樣器，CTO-20AC恒溫柱箱、CBM-20A 通信總線模塊、LCMS-8040型三重串聯(lián)四極桿液相色譜質譜聯(lián)用儀均購自日本島津公司。

1.2孕鼠分組及其產(chǎn)前應激方法、子代鼠飼養(yǎng)方法將妊娠孕鼠20只隨機分為觀察組和對照組各10只。妊娠第14天(孕鼠進入孕晚期)起對觀察組給予束縛應激[4]：將孕鼠束縛置于透明的塑料質地圓柱形裝置(內(nèi)徑6.0 cm)中，裝置兩端留有通風口。為防止大鼠出現(xiàn)應激模式習慣化，每天隨機給予束縛應激，間隔不少于2 h，45 min/次，3次/d，共束縛6 d。對照組孕期不做任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。待兩組子代鼠出生21 d斷奶，雌雄分籠喂養(yǎng)。

1.3子代鼠抑郁樣行為觀察采用糖水偏愛試驗(SPT)。出生29 d時各取20只子代鼠(雌雄對半)進行糖水適應訓練：每籠同時放置兩瓶1%蔗糖的自來水溶液24 h。出生30 d時取兩組子代鼠，禁食、禁水3 h后，同時予一瓶蔗糖水和一瓶自來水。為防止大鼠對飲水瓶位置產(chǎn)生習慣性,0.5 h將蔗糖溶液和自來水交換位置放置。1 h后取走兩瓶液體進行稱重，觀察兩組蔗糖水、自來水的消耗量，計算兩組雌、雄性子代鼠1%糖水消耗比(糖水消耗/糖水消耗 + 自來水的消耗)。糖水消耗比表示大鼠抑郁樣行為的程度，糖水消耗比越低表示大鼠抑郁樣行為(快感缺失)程度越高[6]。

1.4子代鼠海馬組織中Glu、GABA和5-HT檢測①子代大鼠海馬組織取材：將做完SPT的子代鼠斷頭取腦，冰上快速分離海馬，稱重后加入預冷的10倍體積的0.2%甲酸-水溶液，勻漿，取0.2 mL腦勻漿液，加入冰冷的0.2%甲酸乙腈溶液0.4 mL，混勻后于4 ℃放置30 min，4 ℃下12 000 r/min離心3 min，取上清液冰上放置備用。②Glu、GABA和5-HT標準曲線繪制：LC-MS /MS條件見文獻[7]，各種遞質檢測條件的參數(shù)見表1。取100 μg/L混合標準品溶液50 μL，檢測后見各色譜峰無雜質干擾，峰型良好。取各濃度的混合標準品溶液進行LC-MS /MS分析，以Glu、GABA和5-HT的質量濃度為橫坐標，被測物與內(nèi)標峰面積比為縱坐標，進行線性回歸，得到線性回歸方程，并繪制標準曲線。標準曲線的回歸方程包含最低檢測限(見表2)。③子代大鼠海馬組織Glu、GABA和5-HT的檢測：取兩組子代大鼠海馬組織勻漿50 μL 進行LC-MS /MS分析，參照②中Glu、GABA和5-HT的標準曲線回歸方程和所取兩組海馬組織的質量(g)計算海馬組織Glu、GABA和5-HT的相對含量。

表1　Glu、GABA、5-HT檢測離子對及質譜離子化條件

注：Q1和Q3是質量分析器，其質荷比反映串聯(lián)質譜的掃描模式；m/z即質荷比，是離子質量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值。

表2　Glu、GABA、5-HT的線性公式及最低檢測限

2　結果

2.1兩組雌、雄子代大鼠抑郁樣行為比較觀察組雌、雄性子代大鼠1%糖水消耗比分別為63.13±3.47和59.67±3.33，對照組分別為79.22±7.07和78.67±4.72。觀察組雌、雄性子代大鼠1%糖水消耗比與對照組相比，P均<0.05。

2.2兩組子代大鼠海馬組織Glu、GABA和5-HT含量的比較觀察組雌、雄子代大鼠海馬組織Glu的相對含量分別為(24.30±1.00)、(31.22±1.57)ng/g，對照組分別為(21.20±0.90)、(24.01±0.28)ng/g，觀察組雌、雄性子代大鼠海馬組織Glu的相對含量與對照組相比，P均<0.05。觀察組雌、雄子代大鼠海馬組織GABA的相對含量分別為(7.42±0.36)、(8.35±0.39)ng/g,，對照組分別為(13.28±0.38)、(9.94±0.30)ng/g，觀察組雌、雄性子代大鼠海馬組織GABA的相對含量與對照組相比，P均<0.05。觀察組雌、雄子代大鼠海馬組織5-HT的相對含量分別為(0.27±0.02)、(0.26±0.01)ng/g，對照組分別為(0.35±0.03)、(0.29±0.02)ng/g，觀察組雌性子代大鼠海馬組織5-HT的相對含量與對照組相比，P<0.05。

3　討論

近年來，產(chǎn)前應激對子代情感、認知和行為影響的研究受到越來越多的關注，但由于應激的方式、強度、時間及檢測方法的不同，結果也不完全一致。Richardson等[8]的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雌性胎兒受到產(chǎn)前應激的影響更加敏感；而動物實驗的研究[9]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前應激的雌性子代在成年更易感焦慮、抑郁等精神障礙，而雄性子代更易出現(xiàn)認知障礙。本研究通過糖水偏愛試驗，檢測大鼠的糖水消耗比，觀察大鼠抑郁樣行為。結果顯示晚期產(chǎn)前應激組雌、雄子代大鼠的糖水消耗比均顯著降低，且雌、雄之間無顯著性差異，提示晚期產(chǎn)前應激可以導致1月齡子代大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，與我們實驗室以往的曠場實驗和強迫游泳的結果一致[6]。

突觸是神經(jīng)細胞之間信息傳遞的重要結構，突觸前膜產(chǎn)生的神經(jīng)遞質通過特異性的作用于突觸后膜的相應受體將信息在神經(jīng)元之間單向傳遞。腦內(nèi)神經(jīng)遞質的含量和功能正常對于突觸信息傳遞功能非常重要。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，富含5-HT、Glu及GABA受體，它不僅參與記憶的形成和鞏固，而且在情感精神行為調(diào)控中具有重要作用[10]。以往的研究認為，5-HT及其受體的減少或活性下降是抑郁等情感性障礙發(fā)生的內(nèi)在機制[11]。而近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)谷氨酸轉運體1(GLT-1)在海馬的表達，減少突觸間隙的谷氨酸含量，可以減輕應激大鼠的抑郁樣行為[12]；抗抑郁藥AP5和Ro-25-6981的作用可能是通過增加海馬GABA受體A的表達實現(xiàn)的[13]。為進一步探索產(chǎn)前應激引起子代抑郁癥發(fā)生的機制，我們運用LC-MS/MS分析方法檢測大鼠海馬組織中多種遞質的含量。結果顯示，晚期產(chǎn)前應激可以引起1月齡子代大鼠海馬的Glu含量顯著增加，GABA的含量顯著降低，與我們實驗室此前使用高效液相色譜法對衍生化的樣品的檢測結果一致[14]，但是本研究中運用的LC-MS/MS法不需要柱前衍生化，操作簡便、快速、準確。Glu是腦內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質，當細胞間的Glu異常增多時會引起神經(jīng)細胞的興奮性毒性損害，表現(xiàn)為突觸后神經(jīng)元的樹突減少，細胞內(nèi)的Ca2+超載和反應性氧化產(chǎn)物的增加，甚至發(fā)生細胞不可逆死亡。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸的離子型受體拮抗劑MK-801能夠改善子代大鼠的抑郁樣行為可能與減少海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的Ca2+和反應性氧化產(chǎn)物的水平有關[6,15]。這些結果說明海馬Glu的含量異常增多參與產(chǎn)前應激子代大鼠抑郁樣行為的發(fā)生。突觸間隙的谷氨酸含量增加可能與谷氨酸的代謝異常相關，在神經(jīng)細胞和膠質細胞之間存在Glu和谷氨酰胺(Gln)的代謝循環(huán)，此循環(huán)的異?？赡軙淖兺挥|間隙的Glu含量。我們實驗室以往的研究也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前應激可以導致子代大鼠海馬組織的興奮性氨基酸轉運體(EAAT)2和3的表達顯著減少[11]。這些結果說明，產(chǎn)前應激可以引起子代大鼠海馬組織谷氨酸轉運體減少，Glu代謝障礙，突觸間隙的Glu含量增加，海馬神經(jīng)細胞損害，最終導致大鼠抑郁樣行為的發(fā)生。

近年來，抑制性神經(jīng)遞質GABA在情感性精神障礙中的作用得到越來越多的關注。研究[5]表明，GABA能傳遞損害可能參與人類抑郁癥的發(fā)生。本研究結果發(fā)現(xiàn)，晚期產(chǎn)前應激子代大鼠海馬組織的GABA含量顯著減少，結合行為學結果，我們認為GABA的減少可以導致海馬組織內(nèi)GABA能系統(tǒng)的活性減弱，不但可能直接參與了大鼠抑郁樣行為的發(fā)生，而且還可以繼發(fā)性的升高興奮性遞質Glu的水平，進一步惡化大鼠的抑郁樣行為。Yan等[16]最近研究也表明五味子提取物的抗抑郁作用與上調(diào)GABA能系統(tǒng)的活性和下調(diào)谷氨酸能系統(tǒng)的活性有關。這些結果均說明，中樞興奮性遞質和抑制性遞質的失衡可能是促使抑郁癥發(fā)生的原因，在未來的研究中，可以通過下調(diào)谷氨酸能系統(tǒng)的活性，上調(diào)GABA能系統(tǒng)的活性改善抑郁癥。

5-HT能系統(tǒng)的活性降低一直是被認為是抑郁癥的發(fā)病基礎。本研究結果顯示，晚期產(chǎn)前應激組的雌性子代大鼠海馬組織的5-HT顯著減少，而雄性子代的5-HT雖較對照組減少，但是無顯著性差異。此結果說明晚期產(chǎn)前應激導致的1月齡子代大鼠的海馬5-HT含量的變化具有性別差異，似乎與行為學的表現(xiàn)不完全一致。這個結果也側面反映了不是所有抑郁癥患者都是因為單胺能活動的缺陷，正如我們研究中發(fā)現(xiàn)的，產(chǎn)前應激雄性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，但其海馬5-HT水平卻未發(fā)生顯著改變。Rayen等[17]近期研究也發(fā)現(xiàn)，5-HT再攝取抑制劑-氟西汀，可以促進產(chǎn)前應激雌性子代大鼠海馬細胞的增生，改善產(chǎn)前應激導致的雌性子代大鼠的抑郁行為。這些結果說明產(chǎn)前應激對子代大鼠海馬5-HT水平的影響存在性別差異，但是造成性別差異的原因還有待于進一步的研究。

綜上所述，孕鼠晚期產(chǎn)前應激可導致子代大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，且未見性別差異；其機制可能為晚期產(chǎn)前應激增加海馬組織Glu，降低GABA、5-HT含量。

[1] Keeley K.Prenatal influence on behavior of offspring of crowded mice[J].Science,1962,135(3497):44-45.

[2] Walker SP,Wachs TD,Grantham-McGregor S,et al.Inequality in early childhood: risk and protective factors for early child development[J].Lancet,2011,378(9799):1325-1338.

[3] Whiteford HA,Degenhardt L,Rehm J,et al.Global burden of disease attributable to mental and substance use disorders: findings from the Global Burden of Disease Study 2010[J].Lancet,2013,382(9904):1575-1586.

[4] Li X,Need AB,Baez M,et al.Metabotropic glutamate 5 receptor antagonism is associated with antidepressant-like effects in mice[J].J Pharmacol Exp Ther,2006,319(1):254-259.

[5] Fatemi SH,Stary JM,Earle JA,et al.GABAergic dysfunction in schizophrenia and mood disorders as reflected by decreased levels of glutamic acid decarboxylase 65 and 67 kDa and Reelin proteins in cerebellum[J].Schizophr Res,2005,72(2-3):109-122.

[6] Guan L,Jia N,Zhao X,et al.The involvement of ERK/CREB/Bcl-2 in depression-like behavior in prenatally stressed offspring rats[J].Brain Res Bull,2013,99:1-8.

[7] 張蕾,孔令提,孫蘭,等.LC-MS/MS同時測定小鼠腦組織中7種神經(jīng)遞質含量[J].中國實驗方劑學雜志,2013,(20):132-136.

[8] Richardson HN,Zorrilla EP,Mandyam CD,et al.Exposure to repetitive versus varied stress during prenatal development generates two distinct anxiogenic and neuroendocrine profiles in adulthood[J].Endocrinology,2006,147(5):2506-2517.

[9] Glover V,Hill J.Sex differences in the programming effects of prenatal stress on psychopathology and stress responses: an evolutionary perspective[J].Physiol Behav,2012,106(5):736-740.

[10] Galea LA,Wainwright SR,Roes MM,et al.Sex,hormones and neurogenesis in the hippocampus: hormonal modulation of neurogenesis and potential functional implications[J].J Neuroendocrinol,2013,25(11):1039-1061.

[11] Gemmel M,Rayen I,Lotus T,et al.Developmental fluoxetine and prenatal stress effects on serotonin,dopamine,and synaptophysin density in the PFC and hippocampus of offspring at weaning[J].Dev Psychobiol,2016,58(3):315-327.

[12] Liu WX,Wang J,Xie ZM,et al.Regulation of glutamate transporter 1 via BDNF-TrkB signaling plays a role in the anti-apoptotic and antidepressant effects of ketamine in chronic unpredictable stress model of depression[J].Psychopharmacology(Berl),2016,233(3):405-415.

[13] Workman ER,Haddick PC,Bush K,et al.Rapid antidepressants stimulate the decoupling of GABA(B)receptors from GIRK/Kir3 channels through increased protein stability of 14-3-3η[J].Mol Psychiatry,2015,20(3):298-310.

[14] 楊琨,賈寧,宋茜,等.產(chǎn)前應激對子代大鼠海馬神經(jīng)遞質含量的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報,2009,(17):1567.

[15] Sun H,Guan L,Zhu Z,et al.Reduced levels of NR1 and NR2A with depression-like behavior in different brain regions in prenatally stressed juvenile offspring[J].PLoS One,2013,8(11):e81775.

[16] Yan T,Xu M,Wu B,et al.The effect of Schisandra chinensis extracts on depression by noradrenergic,dopaminergic,GABAergic and glutamatergic systems in the forced swim test in mice[J].Food Funct,2016,7(6):2811-2819.

[17] Rayen I,Gemmel M,Pauley G,et al.Developmental exposure to SSRIs,in addition to maternal stress,has long-term sex-dependent effects on hippocampal plasticity[J].Psychopharmacology(Berl),2015,232(7):1231-1244.

Observation of prenatal stress-induced depression-like behavior in offspring rats and its mechanism

JIA Ning1,SUN Qinru,SU Qian

(1 Xi'an Jiaotong University Health Science Center,Xi'an 710061,China)

ObjectiveTo observe the depression-like behavior of the offspring rats from pregnant rats with prenatal stress(PS)and to investigate its mechanism.MethodsTwenty pregnant rats were randomly divided into the PS group and control(CON)group,10 in each.From the 14th d of pregnancy(in late pregnancy),rats in the observation group were given restraint stress,45 min/time,3 times/d,a total of 7 d.Rats in the control group were conventionally fed without any treatment.We took 20 offspring rats(male and female in half)which were born 30 d from each group to undergo sucrose preference test(SPT),and calculated the percentage of 1% sugar water consumption in male and female offspring rats of the two groups.Meanwhile,the concentrations of glutamate(Glu),γ-aminobutyric acid(GABA)and serotonin(5-HT)in hippocampus of the rats were measured by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry(LC-MS/MS).ResultsThe percentages of 1% sugar water consumption in male and female offspring rats of the PS groups was 63.13±3.47 and 59.67±3.33,respectively,and 79.22±7.07 and 78.67±4.72 in the control group(P<0.05).Furthermore,the concentration of Glu was(24.30±1.00)ng/g in the female PS group which was more than that 〔(21.20±0.90)ng/g〕 in the female CON group(P<0.05).Similarly,the concentration of Glu in male PS group was(31.22±1.57)ng/g,which was more than that 〔(24.01±0.28)ng/g〕 in the male CON group(P<0.05).Contrarily,the concentration of GABA in female PS group was(7.42±0.36)ng/g,which was significantly lower than that 〔(13.28±0.38)ng/g 〕 in the female CON group(P<0.05).The concentration of GABA in male PS group was(8.35±0.39)ng/g,which was significantly lower than that 〔(9.94±0.30)ng/g〕 in the female CON group(P<0.05).Only the female PS offspring showed lower 5-HT concentration 〔(0.27±0.02)ng/g〕 as compared with that of the CON group 〔(0.35±0.03)ng/g〕(P<0.05).ConclusionPrenatal stress can result in the depression-like behavior of offspring rats,and its mechanism may be related to that prenatal stress increases the Glu content of hippocampal tissue and decreases the levels of GABA,5-HT of offspring rats.

prenatal stress;depression-like behavior;hippocampus;glutamic acid;γ-aminobutyric acid;5-hydroxytryptamine;animal experiment

國家自然科學基金青年基金項目(31200843);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(xjj2015077)。

賈寧(1974-)，女，博士，講師，碩士研究生導師，主要研究方向為產(chǎn)前應激與子代行為、認知科學。E-mail: jianing@mail.xjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.005

R749

A

1002-266X(2016)27-0016-04

2016-02-23)