劉燕，陸滟霞，周敏，鄭林，李學(xué)農(nóng)

(1 川北醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，四川南充637000；2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;3 南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系)

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抑制miR-101表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

劉燕1,2，陸滟霞3，周敏3，鄭林3，李學(xué)農(nóng)3

(1 川北醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，四川南充637000；2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;3 南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系)

目的觀察抑制miR-101表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。方法取SW480細(xì)胞分為A、B、C組，A組轉(zhuǎn)染miR-101抑制物，抑制miR-101表達(dá)，B組轉(zhuǎn)染無義序列miRNA，C組為不做任何處理的空白組。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)觀察各組細(xì)胞增殖、周期及凋亡情況。結(jié)果隨時(shí)間增加，各組細(xì)胞細(xì)胞增殖的OD值均升高(P均<0.05)；培養(yǎng)第2、3、4、5天A組細(xì)胞增殖的OD值均高于B、C組(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)A組S期細(xì)胞所占比例明顯高于B、C組，G1與G2/M期細(xì)胞所占比例明顯低于B、C組(P均<0.05)。A、B、C組細(xì)胞凋亡率分別為3.29%±0.09%、4.57%±0.21%、2.00%±0.11%( F=230.762;P<0.05)。結(jié)論抑制miR-101表達(dá)可促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期于S期、抑制細(xì)胞凋亡。干擾miR-101后能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖，細(xì)胞S期周期阻滯及抑制細(xì)胞凋亡。

微小RNA;miR-101；結(jié)腸腫瘤；直腸腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

miR-101是微小RNA(miRNA)家族中的一員，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及侵襲等過程中發(fā)揮重要作用[1,2]。miR-101抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[3,4]。目前關(guān)于miR-101對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡影響的相關(guān)研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在低轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480中表達(dá)水平較高，而在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SW620中表達(dá)水平較低，并能靶向調(diào)控RACl的表達(dá)[5]。2013年8月～2014年6月，我們觀察了miR-101SW480細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、材料、試劑及儀器結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480由本實(shí)驗(yàn)室保存，置于含5%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。胰酶購自于杭州吉諾公司，細(xì)胞周期試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2SW480細(xì)胞分組及miR-101抑制物轉(zhuǎn)染方法取適量對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，分為A、B、C組，A組轉(zhuǎn)染miR-101抑制物，抑制miR-101表達(dá)，B組轉(zhuǎn)染無義序列miRNA，所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行；C組為不做任何處理的空白組。轉(zhuǎn)染36 h時(shí)采用熒光定量PCR檢測各組miR-101，A組miR-101的相對表達(dá)量(0.546 1±0.028 7)低于B、C組(分別為0.816 7±0.0597 4、1.000±0)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明轉(zhuǎn)染成功。

1.3各組細(xì)胞增殖情況觀察采用CCK-8法。取轉(zhuǎn)染48 h時(shí)各組細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，2 000/孔，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8試劑后37 ℃孵育2 h，以blank對照孔進(jìn)行調(diào)零，分別于第2、3、4、5天使用Glo MaxTM96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測儀檢測各組OD值，以O(shè)D值表示該組細(xì)胞增殖能力的大小，OD值越大代表細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4各組細(xì)胞周期觀察干預(yù)48 h時(shí)取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，PBS清洗2次，加入胰酶消化，2 000 r/min離心5mim，第2 d于室溫下1 000 r/min離心5min，PBS清洗2次，然后加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min后，加入400 μL PI，混勻后4 ℃避光30 min。采用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞周期G1、S、G2/M期所占比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5各組細(xì)胞凋亡情況觀察干預(yù)48 h時(shí)取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，PBS沖洗2次，2 000 r/min離心5min，收集(1～5)×105細(xì)胞，加入500 μL 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入1 μL AnneXinV-PE，輕輕混勻，4 ℃避光反應(yīng)15 min，加入5 μL7AAD再次混勻，4℃避光孵育15min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖情況比較不同培養(yǎng)時(shí)間A、B、C組細(xì)胞增殖的OD值比較見表1。隨時(shí)間增加，各組細(xì)胞細(xì)胞增殖的OD值均升高(P均<0.05)。分別培養(yǎng)第2、3、4、5天，A組細(xì)胞增殖OD值高于B、C組(P均<0.05)。

表1　不同培養(yǎng)時(shí)間各組細(xì)胞增殖的OD值±s)

2.2各組細(xì)胞周期比較分析轉(zhuǎn)染48 h時(shí)各組細(xì)胞周期比較見表2。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)A組S期細(xì)胞所占比例明顯高于B、C組，G1與G2/M期細(xì)胞所占比例明顯低于B、C組(P均<0.05)。

表2　干預(yù)48 h時(shí)各組細(xì)胞周期分布

2.3各組細(xì)胞凋亡率比較A、B、C組細(xì)胞凋亡率分別為3.29%±0.09%、4.57%±0.21%、2.00%±0.11%，組間兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

miRNAs是一類類似于癌或抑癌基因作用的非編碼小分子RNA家族[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在乳腺癌[1]、肺癌、肝癌、前列腺癌、垂體腺瘤、胰腺癌、骨肉瘤[2，4]、膽囊癌[3]等實(shí)體腫瘤中表達(dá)下調(diào)，可能參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程，起著抑制腫瘤發(fā)生的作用[3]。在肺癌細(xì)胞中，miR-101通過靶向調(diào)控COX-2的表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖與遷移[6,7]。Lv等[8,9]研究表明，在胃癌細(xì)胞及其組織中miR-101的表達(dá)均下調(diào)，并且與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，miR-101可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控EP4受體的表達(dá)[10]。在結(jié)直腸癌中miR-101可調(diào)控EP4受體、PTGS2及ASPN的表達(dá)[11]。miR-101可靶向調(diào)控下調(diào)EZH2抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移能力[12]；CXCR7而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力[13]；靶向作用于Rac1抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生長[14]，本課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)而miR-101能靶向調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞RACl表達(dá)[9]。表明miR-101可能通過靶向調(diào)控RAC1調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，A組細(xì)胞增殖的OD值均高于B、C組，這表明miR-101可能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。Strillaccia 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌患者的癌組織標(biāo)本中miR-101表達(dá)明顯低于其癌旁組織，高表達(dá) miR-101可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。與本研究結(jié)果一致。

對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌，放射治療是重要的治療方式方式，其效果如何，與腫瘤細(xì)胞周期分布密不可分。通常認(rèn)為G2/M期對放療最為敏感，G1次之，S期最不敏感。細(xì)胞發(fā)生G2/M 期阻滯時(shí)將無法完成其DNA 損傷修復(fù),從而引起G2/M 期阻滯延長,細(xì)胞的增殖能力下降,導(dǎo)致細(xì)胞增殖死亡[15,16]。miR-101是否能增強(qiáng)結(jié)直腸癌患者對放療的敏感性，尚有待于進(jìn)一步研究[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，B組細(xì)胞凋亡率明顯高于A、C組，A組細(xì)胞凋亡率明顯高于C組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-101可能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，且轉(zhuǎn)染過程本身可能導(dǎo)致細(xì)胞著損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，抑制miR-101表達(dá)可促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期于S期、抑制細(xì)胞凋亡。干擾miR-101后能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖，細(xì)胞S期周期阻滯及抑制細(xì)胞凋亡。但其具體機(jī)制尚有待于今后進(jìn)一步研究。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272758，81302158)。

李學(xué)農(nóng)(E-mail: leexue0@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.012

R782

A

1002-266X(2016)27-0038-03

2016-02-17)