李聯(lián)平，蔣瑩

(1 海軍總醫(yī)院，北京100048；2 北京市肛腸醫(yī)院)

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·基礎研究·

體外血腦屏障的建立

李聯(lián)平1，蔣瑩2

(1 海軍總醫(yī)院，北京100048；2 北京市肛腸醫(yī)院)

目的利用大鼠腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞于體外建立血腦屏障。方法分別取10只出生7～10 d、2只出生1～3 d的SD大鼠，斷頭處死后取腦組織，分別分離培養(yǎng)腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞，采用免疫細胞染色方法鑒定腦微血管內皮細胞，以腦微血管內皮細胞因子Ⅷ作為標記抗原，以神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)作為標記抗原鑒定星型膠質細胞。以非接觸方式共培養(yǎng)腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞的方法建立體外血腦屏障。接種12 d將電極插入待測Transwell小室(培養(yǎng)模型)、細胞培養(yǎng)液、空白Transwell小室(細胞培養(yǎng)液為媒介)。測定跨膜電阻、測算熒光素鈉滲透系數(shù)(Pe)，衡量模型完整性。結果接種12 d時，模型、細胞培養(yǎng)液、空白Transwell小室的電阻值分別為180、64、112 Ω/cm2。接種12 d時模型Pe為(4.67±0.4)×10-6cm/s。結論成功建立體外血腦屏障，屏障效應較好、完整性較高。

血腦屏障；細胞屏障；動物實驗；大腦；腦微血管內皮細胞;星型膠質細胞

血腦屏障是血液與腦組織間的一種特殊屏障，由微血管內皮、基膜和星型膠質細胞等構成，其中內皮細胞是血腦屏障的主要結構。血腦屏障具有保證腦的內環(huán)境高度穩(wěn)定、保護中樞神經系統(tǒng)的活動機能、阻止微生物和毒素等異物侵入腦組織的功能。以往在體血腦屏障動物實驗存在動物腦組織內藥物濃度較低無法準確測量、動物體內影響因素較多等缺點。血腦屏障模型的研究主要經歷了腦血管碎段模型、腦微血管內皮細胞模型的構建、星型膠質細胞和血管內皮細胞共同模型的培養(yǎng)等3個階段[1]。但目前尚無統(tǒng)一模型鑒定標準[2，3]。我們分離培養(yǎng)了乳鼠腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞，成功構建大鼠體外血腦屏障模型，現(xiàn)將結果報告如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物、試劑及儀器出生1～3 d的SD大鼠(雌雄不等，體質量4～10 g)2只、出生7～10 d的SD大鼠(雌雄不等，體質量8 ～10 g)10只由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供,DMEM、F12培養(yǎng)基、胎牛血清和血管內皮細胞專用培養(yǎng)基購自北京裕恒豐科技有限公司，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B購自北京拜爾迪生物技術有限公司，Hanks平衡液、0.25%胰酶EDTA和膠原酶Ⅱ購自北京翰天生物技術有限公司，熒光素鈉(FLU)和胎牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma-Aldrich化學試劑公司；Transwell-clear小室購自北京康寧公司，抗鼠血管內皮細胞Ⅷ因子抗體、抗鼠神經膠質原纖維酸性蛋白質(GFAP)抗體、AB染色試劑盒和二步法化學免疫檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2腦微血管內皮細胞及星型膠質細胞的體外分離培養(yǎng)取10只出生7～10 d的SD大鼠，斷頭處死后取腦組織，參照文獻[4]分離和純化腦微血管內皮細胞，以血管內皮細胞因子Ⅷ為標記抗原,采用免疫細胞染色方法鑒定(染色細胞呈棕紅色視為陽性)細胞。將培養(yǎng)得到的原代腦微血管內皮細胞傳代至第3代備用。取2只出生1～3 d的SD大鼠，斷頭處死后取腦組織參照方法[5]分離培養(yǎng)星型膠質細胞：剪碎腦皮質層組織，0.25%胰酶-EDTA吹打懸浮，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中消化10 min,200目篩網過濾，取濾過液2 000 r/min離心5 min。棄上清液，懸浮沉淀物，以細胞密度1×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，隔日換液。以GFAP為標記抗原鑒定細胞。腦微血管內皮細胞及星型膠質細胞免疫細胞染色鑒定結果見圖1。

1.3體外血腦屏障模型的建立采用腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞共培養(yǎng)[6]方法建立體外血腦屏障。取適量腦微血管內皮細胞，以1.6×105/mL的細胞密度接種于Transwell小室膜上。另取適量星型膠質細胞，以2.5×105/mL的細胞密度接種于Transwell板底部。上室和下室各自加入1.5、2.5 mL專用培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

注：A為腦微血管內皮細胞；B為星型膠質細胞

圖1腦微血管內皮細胞及星型膠質細胞體外分離鑒定結果

1.4模型完整性鑒定接種12 d取模型，采用細胞電阻儀測定跨膜電阻：校正電阻儀并且平衡電極后，將電極插入待測Transwell小室中，長電極在外部，短電極在內部。用相同方法可測定空白Transwell板(細胞培養(yǎng)液為媒介)和細胞培養(yǎng)液的電阻值。接種12d取模型，采用熒光素鈉滲透性實驗計算跨膜熒光素鈉滲透系數(shù)(Pe)[7]：共培養(yǎng)Transwell板中的細胞融合生長電阻值保持恒定后，將Transwell小室轉移到盛有基礎培養(yǎng)基的六孔板中。37 ℃培養(yǎng)箱預熱15 min，吸取1 μg/mL熒光素鈉基礎培養(yǎng)基1.5 mL置換上室培養(yǎng)液，下室用2.5 mL基礎培養(yǎng)基置換，37 ℃培養(yǎng)箱中進行滲透實驗。采用多功能酶標儀測定熒光素鈉濃度，累積相加濃度即為相應時間點的滲透濃度值，計算Pe[7]。以跨膜電阻和Pe代表模型的完整性。細胞電阻值大小代表細胞生長的好壞，細胞電阻值太小說明細胞沒有融合生長，細胞層存在漏隙。當Pe≥2×10-6cm/sec時說明細胞屏障效應好，模型無滲漏完整性好。

2　結果

接種12 d時模型、細胞培養(yǎng)液、空白Transwell小室的電阻值分別為180、264、112 Ω/cm2。接種12 d時模型Pe為(4.67±0.4)×10-6cm/s。

3　討論

血腦屏障是血液和腦組織間的一種特殊屏障，由微血管內皮、基膜和星型膠質細胞等構成，其中內血管內皮細胞是構成血腦屏障的主要結構。對體外血腦屏障模型的研究，以往文獻大多是使用細胞株來建立模型，且鑒定模型的功能性可靠性較差。本研究應用新生乳鼠，取材方便，并提取大鼠腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞作為原代細胞，用非接觸共培養(yǎng)方式培養(yǎng)細胞，更好的維護了細胞的生長環(huán)境，保持了血管內皮細胞的功能特征[8，9]。腦微血管內皮細胞與星型膠質細胞共培養(yǎng)建立的血腦屏障模型，比單一細胞所建立的模型接近體內細胞的體內的生理狀態(tài)[10]。本研究運用細胞電阻儀監(jiān)測細胞生長情況，當細胞電阻達到峰值，無明顯變化時，說明細胞生長已飽滿。且細胞間連接緊密限制了分子物質旁細胞途徑的擴散滲透，一定程度上達到了體內細胞間的緊密性。

腦微血管內皮細胞能表達多種轉運蛋白和藥物代謝性酶，如P-糖蛋白，細胞色素P-450酶等[8]。其中，P-糖蛋白是一種ATP結合盒轉運蛋白之一，顯著表達在腦微血管內皮細胞腔膜上[12]。它主要以行使細胞排出外來物質的功能職責[12]。P-糖蛋白擁有相當廣泛的底物物質，包括許多不同類的臨床應用藥物：離子鈣通道拮抗劑、各種抑制素、阿片樣物質，HIV蛋白酶抑制劑、免疫抑制劑、腎上腺素拮抗劑、抗菌藥物等[13]。同時，依靠某一藥物抑制內皮細胞中P-糖蛋白，能促進另一藥物通過血腦屏障系統(tǒng)[14]。腦微血管內皮細胞的分離培養(yǎng)注意事項參照文獻[4]。大鼠星型膠質細胞分離培養(yǎng)相對簡單，但需注意幾個問題：①胰酶-EDTA的消化時間和所需消化液濃度。消化時間太短，膠質細胞不能夠完全消化下來，細胞量太少，接種生長就困難。消化時間太長則細胞失去活性不易生長。本研究實驗以消化3～5 min為宜。有文獻報道[15]消化液濃度應為0.125%胰酶-EDTA，本研究經過實驗研究認為使用0.25%胰酶-EDTA效果好，細胞量多易于生長接種。②細胞接種密度。由于膠質細胞生長較快，接種密度宜控制在1×104～1×105/mL之間，密度太大細胞生長受限密度太小生長尤其慢。本研究熒光素鈉所得滲透系數(shù)為(4.67±0.4)×106cm/s與以往的文獻相比相似[16～17],說明所建立的血腦屏障模型達到了實驗研究目的。

人體各種屏障系統(tǒng)是藥物在體內濃度分布不均的重要因素。藥物經過屏障系統(tǒng)時，藥物相互作用是藥物藥效改變或藥物毒副作用加強的重要原因，以前研究藥物相互作用主要聚焦在藥物生物利用度及藥物全身性濃度的改變[18]。

綜上所述，成功建立體外血腦屏障，屏障效應較好、完整性較高。

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A

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2016-02-29)