劉威，王爽，溫娜，王洪羽，金宏

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 1320132 ；2吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

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遠(yuǎn)志皂苷對缺氧/復(fù)氧損傷新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

劉威1，王爽2，溫娜2，王洪羽1，金宏1

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 1320132 ；2吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

目的觀察遠(yuǎn)志皂苷(Sen)對缺氧/復(fù)氧損傷(H/R)新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法對數(shù)生長期新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞分為A、B、C、D、E組，A、B、C、D組分別加入800 μmol/L的H2O2無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生H/R。A、B、C組分別加入終濃度為50、100、200 μmol/L Sen 的DMEM培養(yǎng)液，D、E兩組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時取各組細(xì)胞，采用MTT法檢測各組細(xì)胞生存情況，計(jì)算細(xì)胞存活率。培養(yǎng)48 h時檢測各組細(xì)胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2、乳酸脫氫酶(LDH)及細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。結(jié)果隨Sen濃度升高，細(xì)胞生存率升高，且隨培養(yǎng)時間增加，細(xì)胞生存率升高，P均<0.05。與D組比較，A、B、C組上清液Caspace-3，Bax表達(dá)降低，Bcl-2/Bax升高，SOD活性增加，LDH、MDA表達(dá)降低，P均<0.05。結(jié)論Sen可減輕新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞H/R損傷程度，其機(jī)制可能與其下調(diào)Caspase-3、Bax表達(dá)、提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性有關(guān)。

遠(yuǎn)志皂甙；神經(jīng)細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷；Caspase-3；Bax、Bcl-2乳酸脫氫酶；超氧化物歧化酶；丙二醛

缺氧/復(fù)氧損傷(H/R)是指組織、細(xì)胞在缺血缺氧損傷后血流再通時損傷反而加重的一種情況，多種腦血管疾病的損傷機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞的H/R關(guān)系密切[1]。遠(yuǎn)志皂苷(Sen)是傳統(tǒng)中藥遠(yuǎn)志的提取物，中醫(yī)認(rèn)為其具有安神益智的藥理作用，利用其抗衰老、抗氧化等生物活性廣泛入藥治療心腦血管疾病，但具體作用機(jī)制尚不明確[2]。Caspase-3是一種促凋亡的蛋白酶、Bax、Bcl-2是細(xì)胞凋亡過程中兩個重要的調(diào)控因子。乳酸脫氫酶(LDH)為細(xì)胞線粒體內(nèi)容物，其含量檢測可反映細(xì)胞膜的完整性。超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化作用的酶，脂質(zhì)過氧化物(MDA)是細(xì)胞膜氧化的產(chǎn)物，兩者活力和含量可反映細(xì)胞抗氧化的能力。2015年1月起我們觀察了Sen對H/R新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑新生(出生48 h內(nèi))SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備。Sen標(biāo)準(zhǔn)品購于中國食品藥品檢定研究所。

1.2新生SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、分組及Sen給予方法取對數(shù)生長期的新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞，將細(xì)胞分為A、B、C、D、E組，每組5個復(fù)孔，A、B、C、D組分別加入800 μmol/L的H2O2無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生H/R。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率在40%～60%證明神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生H/R。造模后A、B、C組分別加入終濃度為50、100、200 μmol/L Sen 的DMEM培養(yǎng)液，D、E兩組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液。各組均培養(yǎng)24 h備用。

1.3各組細(xì)胞存活情況觀察采用MTT法。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時對數(shù)生長期各組細(xì)胞，1×105/孔接種于96孔板，每組5個復(fù)孔，PBS清洗，每孔加入150 μL無血清培養(yǎng)液及5 mg/mL MTT20 μL，孵育4 h，離心后取上清，加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶晶體完全溶解后，采用酶標(biāo)儀檢測各組在490 nm 波長處的光密度(OD)值，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(OD對照組-OD干預(yù)組)/OD對照組×100%。

1.4各組細(xì)胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2檢測培養(yǎng)48 h時取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，每孔取上清50 μL，PBS沖洗，4 ℃過夜后吸棄，每孔加入封閉液200 μL，37 ℃孵育1.5 h，加入Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗(1∶1 000)100 μL，4 ℃過夜。加入二抗(1∶1 000)100 μL，37 ℃孵育1.5 h，加入100 μL顯色液室溫避光顯色孵育30 min，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2在492 nm 波長處的吸光度(A值)，以此反應(yīng)其含量。

1.5各組細(xì)胞上清液LDH及細(xì)胞SOD、MDA檢測培養(yǎng)48 h時取各組細(xì)胞采用南京建成LDH試劑盒檢測各組細(xì)胞上清液LDH活性，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。另取各組細(xì)胞，用超聲波破碎儀將其破碎，按南京建成SOD試劑盒(羥胺法)說明步驟測定各樣本吸光度值，計(jì)算各樣本SOD 活力。同樣用試劑盒(TBA法)檢測并計(jì)算MDA含量。

2　結(jié)果

2.1不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較見表1。

表1　不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較±s)

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05；與 B組比較，#P<0.05。

2.2各組細(xì)胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bcl-2/Bax比較結(jié)果見表2。

表2　各組細(xì)胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bcl-2/ Bax比較

注：與D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與 B組比較，#P<0.05。

2.3各組細(xì)胞上清液LDH及細(xì)胞SOD、MDA比較結(jié)果見表3。

表3　各組細(xì)胞上清液LDH及細(xì)胞SOD、MDA活性比較

注：與D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與 B組比較，#P<0.05。

3　討論

H/R損傷的分子機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究表明該損傷與再灌注過程與氧自由基爆發(fā)[3,4]及凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)[5,6]。研究認(rèn)為H/R損傷的具體過程及機(jī)制如下：①細(xì)胞氧化損傷主要是由反應(yīng)ROS引起的，它介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷與各種心腦病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[9]。如線粒體膜破壞時，LDH外漏，因此可通過檢測細(xì)胞外液中LDH活性判斷細(xì)胞受損情況。SOD活性高低直接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力[7]。②H/R損傷可引起細(xì)胞凋亡，該過程與凋亡蛋白及相關(guān)調(diào)控因子有關(guān)。Caspase-3是一種具有凋亡效應(yīng)的蛋白酶，發(fā)揮降解細(xì)胞蛋白作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。Bcl-2與Bax是兩類重要的調(diào)控因子，在缺氧等損傷因素作用下Bax表達(dá)明顯增高，啟動細(xì)胞凋亡程序；在抗缺氧藥物的作用下Bcl-2表達(dá)明顯，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，抑制細(xì)胞凋亡[9]。

遠(yuǎn)志是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的一種中草藥，其富含皂苷類、寡聚糖類、山酮類化合物，在益智、抗退化，催眠等方面有獨(dú)特療效[10，11]。研究[12,13]表明遠(yuǎn)志皂甙可通過提高微管相關(guān)蛋白水平及促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活與生長，具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，且通過多種途徑對不同種類的原代細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[14,15]。在前人研究基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究對神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)機(jī)制。首先利用H2O2建立細(xì)胞缺氧模型，H2O2是ROS的一種，其可迅速透過細(xì)胞膜，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)過氧化反應(yīng)，影響細(xì)胞功能，造成細(xì)胞氧化損傷，常用于制備缺氧液。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，H2O2作用于原代乳鼠神經(jīng)細(xì)胞1 h造成的缺氧損傷可最大程度的模擬細(xì)胞體內(nèi)缺氧損傷，因此本實(shí)驗(yàn)選擇該濃度制備細(xì)胞缺氧模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與E組相比，D組細(xì)胞OD值明顯下降，計(jì)算細(xì)胞存活率在40%～60%之間，說明造模成功。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與D組相比A、B、C三組的OD值在24、48、72 h均升高，說明不同濃度Sen作用不同時間后可提高細(xì)胞存活率，使細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)，其中作用48 h效果較好。由此可見Sen對H/R損傷神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，推測其可能機(jī)制為:①Sen可通過提高膜穩(wěn)定性對抗細(xì)胞受到的H/R損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對各組細(xì)胞SOD活性、LDH、MDA含量測定表明,與D組相比A、B、C各組細(xì)胞LDH外漏減少，說明用Sen后線粒體膜穩(wěn)定性增加；SOD活性增加，MDA生成減少，說明細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)，由此可見Sen可減少氧化損傷對神經(jīng)細(xì)胞膜的破壞,支持該推測。②Sen可減少H/R損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Sen可調(diào)節(jié)Caspase家族基因表達(dá)，減少其級聯(lián)反應(yīng)引起的細(xì)胞蛋白降解，從而保護(hù)細(xì)胞；另外各藥物組Bax下降，說明啟動細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子Bax受到抑制；Bcl-2/Bax比值上調(diào)，進(jìn)一步表明抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子Bcl-2占優(yōu)勢，從而減少H/R損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Sen可減輕新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞H/R損傷程度，其機(jī)制可能與其下調(diào)Caspase-3、Bax表達(dá)、提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性有關(guān)。但其對H/R損傷神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的其他機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(吉科教合字[2015]第408號)。

金宏(E-mail: jinhong0706@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.011

R966

A

1002-266X(2016)27-0036-03

2016-03-28)