仇影影，謝肖磊，邱玲琳，閆洪超

(1徐州醫(yī)學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

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·基礎研究·

轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡變化

仇影影1，謝肖磊1，邱玲琳1，閆洪超2

(1徐州醫(yī)學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

目的觀察轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡變化。方法將目的基因Elf5+EGFP克隆到載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Elf5+EGFP，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆菌落，大量抽提質(zhì)粒。培養(yǎng)人卵巢癌干細胞并分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對照組。重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核表達載體，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載質(zhì)粒，空白對照組不進行轉(zhuǎn)染。采用Western blotting法檢測Elf5蛋白。分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d采用MTT法檢測細胞增殖能力；轉(zhuǎn)染24 h后采用侵襲小室檢測細胞侵襲能力并計算穿膜細胞數(shù)；轉(zhuǎn)染24 h后流式細胞術(shù)檢測不同周期細胞及凋亡細胞。結(jié)果成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核細胞表達載體，重組質(zhì)粒組細胞中Elf5蛋白穩(wěn)定表達。轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d重組質(zhì)粒組細胞增殖能力低于空白對照組和空質(zhì)粒組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒組穿膜細胞數(shù)少于空質(zhì)粒組、空白對照組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒組G0/G1期細胞百分比高于空質(zhì)粒組、空白對照組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒組細胞凋亡率高于空質(zhì)粒組、空白對照組(P均<0.05)。結(jié)論轉(zhuǎn)染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力受到抑制，細胞凋亡增多。

Elf5基因；卵巢癌；腫瘤干細胞；細胞增殖；細胞凋亡

在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌惡性程度最高，病死率居于首位[1]。卵巢癌之所以易轉(zhuǎn)移和復發(fā)，根本原因在于腫瘤干細胞[2～4]。我們前期研究篩選出具有腫瘤干細胞特征的卵巢癌干細胞(以人HO8910細胞系為實驗對象)，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)篩選出的細胞具有較強的分化、自我更新能力，并有多藥耐藥性較高的干細胞相關(guān)基因表達水平和體內(nèi)成瘤特性[5]。Elf5是Ets基因家族成員之一，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。Elf5與卵巢癌干細胞的關(guān)系目前尚未見報道，為此，2015年1～10月，我們觀察了轉(zhuǎn)染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡的變化，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶及DNA marker購自Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒及瓊脂糖購自天根生化科技有限公司；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司；無乙水醇、異丙醇、丙三醇及無水氯化鈣購自北京國藥集團化學試劑有限公司；人卵巢癌干細胞由本課題組保存；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司； Liptapfector脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Elf5一抗及Transwell 小室購自美國Chemicon公司；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

1.2pcDNA3.1- Elf5+EGFP載體的構(gòu)建及鑒定目的基因上下游引物分別加BamHⅠ、EcoRⅠ及保護堿基，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成引物，將oligo溶解成50 μmol/L，進行兩輪PCR反應，利用Agarose電泳并切膠回收Elf5+EGFP基因片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分別對Elf5+EGFP基因片段和載體pcDNA3.1進行酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收。用T4DNA ligase連接雙酶切，得到Elf5+EGFP基因片段和線性化載體。氯化鈣法制備感受態(tài)細胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，從平板上鑒定并挑選陽性克隆菌落，置于含LB培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)。抽提菌液質(zhì)粒進行雙酶切鑒定并測序。測序結(jié)果與目的基因序列比對無誤后，將菌液接種于LB培養(yǎng)基，進行質(zhì)粒抽提，獲得足夠的重組質(zhì)粒。

1.3細胞分組與Elf5基因轉(zhuǎn)染人卵巢癌干細胞用含EGF、bFGF、Noggi、LIF的培養(yǎng)基培養(yǎng)，分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對照組。重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- Elf5+EGFP真核表達載體，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載質(zhì)粒，空白對照組不進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，用G418培養(yǎng)基對已轉(zhuǎn)染細胞進行篩選并傳代培養(yǎng)。Western blotting法檢測Elf5蛋白。

1.4細胞增殖能力觀察將三組細胞按1.5×104/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板，分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d后加入MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)，最后加入二甲基亞砜終止反應。將96孔培養(yǎng)板置于BOIBASE2000全自動酶標儀上，在490 nm波長處測定吸光度值(A值)，代表細胞增殖能力。

1.5細胞侵襲能力觀察轉(zhuǎn)染24 h后采用侵襲小室檢測卵巢癌干細胞的體外侵襲能力。分離并提取各組細胞懸液，以105/孔將細胞接種于侵襲膜上并培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后去除膜上基質(zhì)膠及殘留細胞，固定并進行染色，倒置顯微鏡下觀察并計算穿膜細胞數(shù)，反映細胞侵襲能力。

1.6不同周期細胞檢測轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化、洗滌并離心細胞，固定細胞，加100 μL PBS并吹打細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度，用流式細胞儀分析不同周期細胞分布情況。

1.7凋亡細胞檢測轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化、洗滌并離心細胞，固定細胞，加100 μL PBS并吹打細胞，制成單細胞懸液，按annexin V-PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書進行染色，采用流式細胞術(shù)測算細胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1pcDNA3.1- Elf5+EGFP載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染情況酶切結(jié)果顯示，在1 518 bp位置出現(xiàn)明顯條帶，與預計擴增片段大小相符，對照組未擴增出條帶；DNA序列分析結(jié)果顯示，目的基因序列與GenBank中基因序列完全相同，目的基因插入方向正確，證實重組質(zhì)粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，細胞中Elf5蛋白表達上調(diào)，而空質(zhì)粒組及空白對照組未檢測到Elf5蛋白表達。

2.2各組細胞增殖能力比較轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d重組質(zhì)粒組A值低于空白對照組和空質(zhì)粒組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組轉(zhuǎn)染后不同時間A值比較

注：與重組質(zhì)粒組相比，*P<0.05。

2.3各組細胞侵襲能力比較重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對照組穿膜細胞數(shù)分別為(92.1±2.7)、(149.6±4.6)、(147.4±5.3)個，重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組、空白對照組相比，P均<0.05。

2.4各組不同周期細胞分布比較重組質(zhì)粒組G0/G1期細胞百分比高于空質(zhì)粒組、空白對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組不同周期細胞分布比較±s)

注：與重組質(zhì)粒組相比，*P<0.05。

2.5各組細胞凋亡率比較重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、空白對照組細胞凋亡率分別為31.4%±1.9%、9.1%±2.2%、8.7%±1.5%，重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組、空白對照組相比，P均<0.05。

3　討論

目前研究[8,9]表明，卵巢癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移及復發(fā)與卵巢癌干細胞的無限增殖、自我更新和多向分化能力有密切關(guān)系。Ets家族成員在正常細胞的增殖、生長、凋亡過程中發(fā)揮重要作用[10]。Elf5屬于其成員之一，位于人類染色體11q13～15，此區(qū)域與其他脆性位點一樣，易出現(xiàn)雜合性缺失。Elf5的完整結(jié)構(gòu)域包含參與蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域、與蘇氨酸/半胱氨酸核心序列結(jié)合的基序及兩個共性結(jié)構(gòu)域[6]。Elf5基因在胎盤滋養(yǎng)細胞、上皮外分泌腺和人類乳腺等器官中均有表達，但表達程度各不相同[11～15]。正常情況下，Elf5不僅可調(diào)節(jié)腺泡細胞的產(chǎn)生，還可影響胚胎發(fā)育[16]。有學者[17]研究表明，Elf5基因的雜合性缺失可導致乳腺成體干細胞增加，促進乳腺癌發(fā)病。近年來國外眾多學者[18～20]也認為Elf5是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在抑癌基因，有望成為乳腺癌新的治療靶點。關(guān)于Elf5基因?qū)θ寺殉舶└杉毎飳W行為的影響，目前報道較少。

本研究首先成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP，并將其成功轉(zhuǎn)染人卵巢癌干細胞，然后從多方面研究了Elf5在體外的一系列生物學作用。我們發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒組細胞增殖能力低于空質(zhì)粒組及空白對照組，表明Elf5基因?qū)β殉舶└杉毎鲋尘哂忻黠@抑制及延緩作用。重組質(zhì)粒組G0/G1期細胞百分比高于空質(zhì)粒組、空白對照組，提示Elf5基因可抑制G0/G1期進展到S期、G2/M期，進一步推測Elf5基因?qū)β殉舶└杉毎脑鲋骋种谱饔每赡芘c干擾細胞周期有關(guān)。侵襲小室實驗結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組的穿膜細胞數(shù)少于空質(zhì)粒組及空白對照組，表明Elf5基因可限制卵巢癌干細胞的侵襲及運動能力。本研究結(jié)果還顯示，重組質(zhì)粒組細胞凋亡率高于其余兩組，提示Elf5基因不僅能抑制卵巢癌干細胞增殖，還可促進其凋亡。但對于Elf5基因通過何種機制影響卵巢癌干細胞的生物學行為，目前尚處于初級研究階段。在以后的研究中，我們還將進一步探索Elf5基因的具體作用機制。

[1] Vargas-Hernández VM,Moreno-Eutimio MA,Acosta-Altamirano G,et al.Management of recurrent epithelial ovarian cancer[J].Gland Surg,2014,3(3):198-202.

[2] Zhang S,Chan M,Balch C,et al.Identification and characterization of cancer stem-like cells from human ovarian carcinomas[J].Biomass Bioenergy,2003,25(6):623-636.

[3] Bapat SA.Human ovarian cancer stem cells[J].Reprod,2010,140(1):33-41.

[4] Djordjevic B,Stojanovic S,Conic I,et al.Current approach to epithelial ovarian cancer based on the concept of cancer stem cells[J].J BUON,2012,17(4):627-636.

[5] Yan HC,Fang LS,Xu J,et al.The identification of the biological characteristics of human ovarian cancer stem cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(22):3497-3503.

[6] Zhou J,Ng AY,Tymms MJ,et al.A novel transcription factor,ELF5,belongs to the ELF subfamily of ETS genes and maps to human chromosome 11p13-15,a region subject to LOH and rearrangement in human carcinoma cell lines[J].Oncogene,1998,17(21):2719-2732.

[7] Choi Y,Sinha S.Determination of the consensus DNA-binding sequence and a transcriptional activation domain for ESE-2[J].Biochem J,2006,398(3):497-507.

[8] Hu L,McArthur C,Jaffe RB.Ovarian cancer stem-like side-population cells are tumourigenic and chemoresistant[J].Br J Cancer,2010,102(8):1276-1283.

[9] Shah MM,Landen CN.Ovarian cancer stem cells: are they real and why are they important[J].Gynecol Oncol,2014,132(2):483-489.

[10] Lee HJ,Ormandy CJ.Elf5,hormones and cell fate[J].Trends Endocrinol Metab,2012,23(6):292-298.

[11] Lapinskas EJ,Palmer J,Ricardo S,et al.A major site of expression of the ets transcription factor Elf5 is epithelia of exocrine glands[J].Histochem Cell Biol,2004,122(6):521-526.

[12] Myriam H,Ramya U,Paul T,et al.ELF5-enforced transcriptional networks define an epigenetically regulated trophoblast stem cell compartment in the human placenta[J].Hum Mol Genet,2010,19(12):2456-2467.

[13] Lee HJ,David GO,Anita L,et al.Progesterone drives mammary secretory differentiation via RankL-mediated induction of Elf5 in luminal progenitor cells[J].Development,2013,140(7):1397-1401.

[14] Lapinskas EJ,Svobodova S,Davis ID,et al.The Ets Transcription Factor ELF5 Functions as a Tumor Suppressor in the Kidney[J].Twin Res Hum Genet,2011,14(4):316-322.

[15] Pearton DJ,Smith CS,Redgate E,et al.Elf5 counteracts precocious trophoblast differentiation by maintaining Sox2 and 3 and inhibiting Hand1 expression[J].Dev Biol,2014,392(2):344-357.

[16] Lee HJ,Hinshelwood RA,Bouras T,et al.Lineage specific methylation of the elf5 promoter in mammary epithelial cells[J].Stem Cells,2011,29(10):1611-1619.

[17] Rumela C,Wei Y,Rose-Anne R,et al.Elf5 regulates mammary gland stem/progenitor cell fate by influencing notch signaling[J].Stem Cells,2012,30(7):1496-1508.

[18] Rumela C,Julie H,Mario AB,et al.Elf5 inhibits the epithelial-mesenchymal transition in mammary gland development and breast cancer metastasis by transcriptionally repressing Snail2[J].Nat Cell Biol,2012,14(11):1212-1222.

[19] Kalyuga M,Gallegoortega D,Lee HJ,et al.ELF5 suppresses estrogen sensitivity and underpins the acquisition of antiestrogen resistance in luminal breast cancer[J].PLoS Biol,2012,10(12):252-253.

[20] Frend HT,Watson CJ.Elf5 - breast cancer's little helper[J].Breast Cancer Res,2013,15(2):307-307.

閆洪超(E-mail：1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.008

R737.31

A

1002-266X(2016)19-0025-03

2015-12-04)