沈君豪，方娟，郭興榮，桂卉，涂漢軍，阮緒芝

(湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000)

?

·論著·

酵母雙雜交技術(shù)篩選宮頸癌HeLa細(xì)胞cDNA文庫中FAM92A1-289關(guān)聯(lián)蛋白

沈君豪，方娟，郭興榮，桂卉，涂漢軍，阮緒芝

(湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000)

目的應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從宮頸癌HeLa細(xì)胞cDNA文庫中篩選FAM92A1-289關(guān)聯(lián)蛋白。方法構(gòu)建酵母雙雜交pGBKT7-FAM92A1-289誘餌載體，轉(zhuǎn)化至酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞中。利用Clontech GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)篩選HeLa細(xì)胞cDNA文庫中與FAM92A1-289相互作用的蛋白質(zhì)，用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-a-Gal雙重篩選實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，對篩選結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對克隆重復(fù)率較高的蛋白進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，將β-半乳糖苷酶活性陽性的克隆進(jìn)行測序并分析。結(jié)果成功構(gòu)建酵母雙雜交pGBKT7-FAM92A1-289誘餌載體，可在酵母細(xì)胞中正常表達(dá)FAM92A1-289，且對酵母細(xì)胞無毒性，不存在自激活現(xiàn)象。篩選出在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培養(yǎng)基及含X-a-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培養(yǎng)基上均能生長且β-半乳糖苷酶活性陽性的克隆9個(gè)。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)4種蛋白重復(fù)率較高，即增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間室標(biāo)記物53(ERGIC-53)、重組人BCL2相關(guān)永生基因1(BAG1)，并均與FAM92A1-289存在相互作用。結(jié)論利用酵母雙雜交技術(shù)在Hela細(xì)胞cDNA文庫中成功篩選出與FAM92A1-289相互作用的蛋白，為進(jìn)一步研究FAM92A1-289的功能提供了新線索。

FAM92A1-289；酵母雙雜交技術(shù)；宮頸癌；HeLa細(xì)胞；增殖細(xì)胞核抗原；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間室標(biāo)記物53；BCL2相關(guān)永生基因重組人BCL2相關(guān)永生基因1；半乳糖凝集素1

FAM92A1-289是Ruan等[1]于2007年發(fā)現(xiàn)并克隆的新基因，其編碼蛋白含289個(gè)氨基酸，屬于FAM92A1家族。研究[2～5]發(fā)現(xiàn)FAM92A1-289定位于細(xì)胞核，在胚胎發(fā)育各個(gè)階段、成人各個(gè)組織中都有表達(dá)，其在腫瘤組織和胚胎組織等增殖旺盛的細(xì)胞中表達(dá)水平較高[1]。FAM92A1-289是細(xì)胞核中與細(xì)胞增殖有關(guān)的小分子蛋白質(zhì)，如果能找到與FAM92A1-289相關(guān)聯(lián)的蛋白，將為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究提供線索。2013年12月～2014年12月，本研究采用酵母雙雜交技術(shù)從宮頸癌HeLa細(xì)胞cDNA文庫中篩選FAM92A1-289關(guān)聯(lián)蛋白，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料HeLa細(xì)胞、酵母菌株AH109、大腸桿菌宿主菌DH5a、克隆有FAM92A1-289基因CDS序列的質(zhì)粒pCDNA3.1-FAM92A1-289、酵母表達(dá)載體pGBKT7及相關(guān)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；酵母雙雜交所用試劑與材料、RNA提取試劑盒、cDNA文庫構(gòu)建試劑盒均購自TaKaRa公司；小鼠C-myc單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體、預(yù)染蛋白Marker和DAB顯色試劑盒購自北京天根科技公司。

1.2誘餌表達(dá)載體pGBKl7-FAM92A1-289的構(gòu)建及驗(yàn)證根據(jù)GenBank中人FAM92A1-289基因序列設(shè)計(jì)引物，引入BamH Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位點(diǎn)，P1序列為5′-ACTGGATCCAATCCCCGTCCTTG-3′；P2序列為5′-AGACTGCAGCTGCTTGTTGATCCTT-3′。以本實(shí)驗(yàn)室保存的pCDNA3.1-FAM92A1-289質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增FAM92A1-289基因片段，BamHⅠ和PstⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和酵母表達(dá)載體pGBKT7；經(jīng)瓊脂糖核酸凝膠電泳回收FAM92A1-289片段和雙酶切載體pGBKT7，4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；經(jīng)PCR及質(zhì)粒酶切鑒定，獲得正確插入FAM92A1-289片段的誘餌質(zhì)粒。酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化均參照Clontech公司酵母手冊提供的方法進(jìn)行。采用PEG/LiAC法將pGBKT7-FAM92A1-289轉(zhuǎn)化到酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞中，鋪于SD/-Trp平板，30 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，直至白色克隆長出。隨機(jī)挑取5個(gè)菌落進(jìn)行PCR反應(yīng)，驗(yàn)證誘餌質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)化到AH109細(xì)胞中；采用Western blotting法檢測誘餌蛋白；參考文獻(xiàn)[6]方法驗(yàn)證誘餌質(zhì)粒的毒性和自激活作用。

1.3HeLa細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建取生長良好的HeLa細(xì)胞，收集于1.5 mL離心管中，PBS洗3次。按說明書提取細(xì)胞總RNA。取7 μL進(jìn)行電泳檢測，剩余置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按說明書操作合成cDNA，純化回收長度大于400 bp的DNA片段，將回收后的DNA與線性化的pGADT7-Rec載體連接，以電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α細(xì)胞，稀釋10倍后涂于100塊LB+Amp平板，待菌落長出后刮下菌苔，懸浮于20%甘油保存液中，-80 ℃保存，此即為cDNA擴(kuò)增文庫。取10 μL擴(kuò)增文庫的菌液，進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度均取100 μL涂布LB+Amp平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，計(jì)算每個(gè)稀釋梯度平板上生長的菌落數(shù)量。按照公式(平板上克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×103/涂布體積)計(jì)算cDNA文庫滴度。隨機(jī)挑取16個(gè)在平板上生長的單克隆，以pGADT7載體上的序列設(shè)計(jì)引物pGADT7-F和pGADT7-R，PCR反應(yīng)檢測插入片段大小，提取文庫質(zhì)粒備用。

1.4FAM92A1-289相互作用蛋白的篩選

1.4.1文庫質(zhì)粒的大規(guī)模轉(zhuǎn)化取1 mL誘餌菌株感受態(tài)細(xì)胞依次加入cDNA文庫質(zhì)粒100 μg、SS DNA 200 μL，加入6 mL PEG/LiAc劇烈震蕩后以30 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)30 min；加入700 μL的DMSO緩緩倒置混勻8次，42 ℃水浴熱休克15 min，每隔5 min混勻1次；熱休克結(jié)束后立即插入冰浴中冷卻2 min，室溫下12 000 r/min離心2 min后棄上清；加入10 mL 1×TE重懸沉淀細(xì)胞，取200 μL涂布在SD/-leu/-His/-Trp三缺平板上，30 ℃培養(yǎng)直至白色酵母長出。

1.4.2β-半乳糖苷酶活性檢測與誘餌蛋白相互作用的蛋白將激活LacZ，用β-半乳糖苷酶催化X-α-gal產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，使酵母變藍(lán)。以轉(zhuǎn)化了pGBKT7-53和pGBKT7-lam的AH109分別作為陽性對照和陰性對照，將長出的單克隆劃線接種于含X-α-gal的SD/-leu/-His/-Trp三缺平板上。選取變藍(lán)克隆，重新劃線接種至含有X-α-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺平板上培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)接3次后，選取仍能變藍(lán)的克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測[7]。

1.4.3酵母質(zhì)粒的提取與轉(zhuǎn)化將經(jīng)鑒定為陽性的酵母單克隆大規(guī)模培養(yǎng)后提取酵母質(zhì)粒。將提取的酵母質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于LB+Amp平板，37 ℃培養(yǎng)，待長出菌落后保存菌株并提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.4.4陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證將提取出的質(zhì)粒分別與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FAM92A1-289再次轉(zhuǎn)化酵母宿主菌AH109，挑取單克隆劃線接種于含有X-α-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺平板上，將經(jīng)多次重復(fù)鑒定為陽性的文庫質(zhì)粒再次測序。

1.5質(zhì)粒生物信息學(xué)分析將測序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行同源性比較，并做生物信息學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1誘餌質(zhì)粒構(gòu)建情況PCR擴(kuò)增出的FAM92A1-289片段長度為846 bp(圖1A)；重組質(zhì)粒pGBKT7-hFAM92A1雙酶切后獲得2條清晰條帶，即目的基因和載體片段，大小與預(yù)期相符(圖1B)；誘餌質(zhì)粒pGBKT7-hFAM92A1轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞的菌落經(jīng)PCR反應(yīng)，獲得長度900 bp的條帶，表明重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-hFAM92A1成功轉(zhuǎn)化到酵母AH109細(xì)胞(圖1C)。Western blotting結(jié)果顯示誘餌質(zhì)粒在酵母AH109細(xì)胞中成功表達(dá)。紫外分光光度計(jì)檢測OD600值確認(rèn)重組質(zhì)粒對酵母細(xì)胞無毒性作用。將誘餌菌株與對照菌株同時(shí)分別涂于SD/-Trp、SD/-Trp-his、SD/-Trp-ade、SD/-Trp-leu平板，培養(yǎng)3 d發(fā)現(xiàn)SD/-Trp平板都有菌落長出，其余平板無菌落長出，說明重組質(zhì)粒無自激活作用。

圖1　FAM92A1-289片段、重組質(zhì)粒及誘餌質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果

2.2HeLa細(xì)胞cDNA文庫構(gòu)建情況提取的HeLa細(xì)胞總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳示總RNA 28S、18S清晰且完整(圖2A)，純化的mRNA清晰可見(圖2B)。構(gòu)建的HeLa細(xì)胞cDNA文庫滴度為1.7×106CFU。從文庫中隨機(jī)挑選16個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，顯示文庫重組率高(圖2C)。

2.3FAM92A1-289相互作用蛋白篩選結(jié)果文庫質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化誘餌菌株后，涂布含X-α-gal的SD/-leu/-His/-Trp 3缺培養(yǎng)基上，檢測報(bào)告基因Lac Z的表達(dá)，經(jīng)過3次重復(fù)篩選，選取一直呈藍(lán)色的克隆106個(gè)，經(jīng)β-半乳糖苷酶活性檢測后得到9個(gè)疑似陽性克隆，經(jīng)回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并通過生物信息學(xué)分析篩選出4種蛋白，分別為增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間室標(biāo)記物53(ERGIC-53)、重組人BCL2相關(guān)永生基因1(BAG1)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)。

圖2　HeLa細(xì)胞cDNA文庫構(gòu)建驗(yàn)證結(jié)果

3　討論

人類基因組測序計(jì)劃已經(jīng)完成，逐漸闡明基因的功能，特別是胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)及功能研究是當(dāng)前功能基因組研究的重點(diǎn)。重組cDNA表達(dá)文庫血清學(xué)分析(SEREX)是篩選重要新基因的有效方法。我們由血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫家兔所得的抗血清來篩選爪蟾卵母細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫，從理論上講，篩選到的陽性克隆分子應(yīng)該是與血管生成和胚胎發(fā)育相關(guān)的重要功能基因。CV973659是上述SEREX技術(shù)篩選出的一個(gè)高度保守的基因克隆，生物信息學(xué)分析顯示CV973659在多個(gè)物種中高度保守，因此我們選擇CV973659及其人類同源基因FAM92A1[1]進(jìn)行基因克隆和功能研究。

酵母雙雜交系統(tǒng)用于研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，靈敏度高。為克服酵母雙雜交系統(tǒng)存在的假陽性較高的缺點(diǎn)，選擇多個(gè)營養(yǎng)缺陷標(biāo)記能大大降低假陽性的產(chǎn)生。本研究應(yīng)用酵母雙雜交法對HeLa細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行篩選，獲得了4種與FAM92A1-289相互作用的蛋白分子，生物信息學(xué)分析表明四者有共同特點(diǎn)，即在增殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡等過程，多與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。

PCNA是DNA聚合酶的輔助蛋白，在增殖細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與DNA復(fù)制過程，其結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中高度保守，在S期細(xì)胞中高表達(dá)[8～11]。PCNA能與檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白R(shí)ad9、Hus1形成環(huán)狀復(fù)合物，將多種修復(fù)相關(guān)蛋白引導(dǎo)到DNA損傷部位，參與DNA的損傷修復(fù)；PCNA還可與細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、依賴細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)和CDK抑制蛋白(CKI)相互作用，形成不同復(fù)合體，調(diào)控細(xì)胞周期；PCNA通過與腫瘤抑制因子(ING1)結(jié)合從而誘導(dǎo)紫外損傷細(xì)胞凋亡[8～10]；PCNA作為內(nèi)源性增殖細(xì)胞標(biāo)志物，可應(yīng)用于腫瘤病理診斷，指導(dǎo)臨床用藥[11]。ERGIC-53是廣泛存在的循環(huán)蛋白，在細(xì)胞蛋白分泌轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，與分泌性糖蛋白形成、運(yùn)輸及腫瘤發(fā)生有關(guān)，為腫瘤耐藥相關(guān)基因[12，13]。通過RNAi抑制耐藥腫瘤細(xì)胞株中ERGIC-53表達(dá)，可使耐藥表型逆轉(zhuǎn)[12，13]。BAG1在正常組織中幾乎不表達(dá)，但在乳腺癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌等腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，可與BCL-2形成復(fù)合物而增強(qiáng)抗凋亡能力，在腫瘤的發(fā)病與侵襲過程中發(fā)揮十分重要的作用[14，15]。BAG1可經(jīng)由分子伴侶Hsp70、Hsc70介導(dǎo)，與多種底物蛋白發(fā)生相互作用，從而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等功能[14～17]。大量研究表明，BAG1可促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。Galectin-1是一種分布廣泛、作用復(fù)雜的半乳糖結(jié)合蛋白，其在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，并廣泛表達(dá)于中樞和外周免疫組織細(xì)胞中，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。Galectin-1在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其可通過與癌基因H-Ras相互作用，增強(qiáng)Ras介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[18，19]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM92A1-289的非洲爪蟾同源基因xVAP019在胚胎廣泛表達(dá)且在增殖旺盛的外胚層細(xì)胞中高表達(dá)[20]，提示其在神經(jīng)細(xì)胞增殖及凋亡中起重要作用。我們將進(jìn)一步研究FAM92A1-289與各關(guān)聯(lián)蛋白的作用方式，探索FAM92A1-289在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控中的具體作用機(jī)制。

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Screening of interacting proteins of FAM92A1-289 in Hela cell cDNA library by using yeast two-hybrid technique

SHEN Junhao,FANG Juan,GUO Xingrong,GUI Hui,TU Hanjun,RUAN Xuzhi

(Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

ObjectiveTo screen the interacting proteins of FAM92A1-289 in Hela cell cDNA library by yeast two-hybrid technique.MethodsThe bait plasmid pGBKT7-FAM92A1-289 was constructed and then transformed into yeast competent cells AH109.Clontech GAL4 yeast two-hybrid assay was performed to screen the interacting proteins of FAM92A1-289 in the Hela cell cDNA library.SD nutrient medium and X-a-Gal were used for selecting and screening.Moreover,back-cross was performed to confirm the interaction of identified proteins,and bioinformatics was used to analyze the sequences of clones of positive β-galactosidase.ResultsThe bait plasmid pGBKT7-FAM92A1-289 was successfully constructed and expressed FAM92A1-289 in yeast cells,showing no toxicity and self-activation.Nine colonies were identified after β-galactosidase test and selection of SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp plates containing X-a-Gal.Bioinformatics analysis shows four proteins had high repetition-rate,such as proliferating cell nuclear antigen (PCNA),galectin-1,endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment marker 53(ERGIC-53) and recombinant human BCL2-associated athanogene 1(BAG1).Furthermore,back-cross proved there was interaction between the identified proteins.ConclusionThe proteins interacting with FAM92A1-289 are successfully identified by yeast two-hybrid technique,which can provide clues for further investigation of the function of FAM92A1-289.

FAM92A1-289; yeast two-hybrid technique; cervical carcinoma; HeLa cell; proliferating cell nuclear antigen; endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment marker 53; recombinant human BCL2-associated athanogene 1; galectin-1

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012FFB02001)。

沈君豪(1984-)，男，碩士，主要研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: sjhkl2015@163.com

簡介：阮緒芝(1966-)，女，博士、教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤分子生物學(xué)。E-mail: ruanxuzhi@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.001

Q78

A

1002-266X(2016)19-0001-04

2015-11-18)