鞏文藝　韓　冬（河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001）

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黃芪多糖對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響*

鞏文藝△韓冬
（河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001）

目的 觀察黃芪多糖 （APS）對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響并探討其作用機制。方法 取120只實驗用大鼠隨機分為6組：假燒傷組、模型組、APS低、中、高（100、200、400 mg/kg）組和地塞米松（5 mg/kg）組；除假燒傷組外，其余各組均采用92℃水浴18 s的方法制備30%TBSAⅢ度燒傷大鼠模型。測定血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）和肌鈣蛋白T（cTnT）含量，HE染色觀察心肌組織病理性形態(tài)學(xué)變化，測定心肌組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT、MPO）活性，測定血清中總抗氧化能力（T-AOC）水平和丙二醛（MDA）含量；酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清中炎癥細(xì)胞因子（CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10）含量水平。結(jié)果 與模型組比較，APS中、高劑量組大鼠血清中AST、CPK、LDH和cTnT含量顯著降低，心肌組織病變呈不同程度好轉(zhuǎn)，以APS高劑量組效果最為顯著；APS中、高劑量組心肌組織中SOD、CAT活性顯著升高、MDA含量顯著降低，其中高劑量組GSH-Px、MPO活性和T-AOC水平顯著升高；APS中、高劑量組血清中CRP、TNF-α、IL-6含量顯著降低，其中高劑量組IL-1含量顯著降低且IL-10含量顯著升高；上述差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 APS通過改善抗氧化酶活性、提高氧自由基清除能力和降低炎癥細(xì)胞因子而對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響起抑制作用。

黃芪多糖燒傷氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)

【Abstract】Objective：To investigate the effects and mechanism of Astraglus Polysaccharides（APS）on oxidative stress and inflammatory responses in severely burned rats.Methods：One hundred and twenty experimental rats were randomly devided into six groups：sham burned group，the model group，APS（100，200，400 mg/kg）groups and Dexamethasone（5 mg/kg）group.All groups，except sham burned group，were made by bathing in 92℃water for 18s after epilation.The content of AST，CPK，LDH and cTnT in serum were determined；the histopathological changes of myocardial tissue was observed by HE staining；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and MPO in myocardial tissue were measured；the level of T-AOC and the content of MDA in serum were detected；the level of TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8 and IL-10 in serum were also determined.Results：Compared with the model group，the content of AST，CPK，LDH and cTnT in serum of APS（200，400 mg/kg）groups were significantly decreased；the histopathological changes of APS groups were significantly improved，especially in the APS 400mg/kg group；the activity of SOD and CAT in APS（200，400 mg/kg）groups increased significantly and the contents of MDA decreased significantly；the activity of GSH-Px，MPO and the level of T-AOC in APS 400mg/kg group significantly increased；the level of CRP，TNF-α，IL-6 in APS（200，400 mg/kg）treated groups significantly decreased；the level of IL-1 in APS 400mg/kg group significantly decreased and the IL-10 significantly increased；all of the differences above were significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：APS has inhibitory effects on oxidative stress and inflammatory responses in severely burned rats by improving the activity of antioxidant enzymes，enhancing radical scavenging and down-regulating the content of inflammatory cytokines.

【Key words】Astraglus Polysaccharides；Burn；Oxidative stress；Inflammation

嚴(yán)重?zé)齻粌H損害皮膚和皮下組織等直接受熱力損傷的組織和器官，還可引起全身各組織器官并發(fā)癥的發(fā)生。其中心肌損傷是燒傷早期即出現(xiàn)的并發(fā)癥之一，還可誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)［1-2］。劉晟等［3］研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷是燒傷所致心肌損傷的重要病理機制之一，這也為研發(fā)降低燒傷損傷的新型藥物提供了新的思路。黃芪多糖（APS）是中藥黃芪的主要活性成分之一，是目前研究比較深入、臨床應(yīng)用比較廣泛的中藥提取物，具有抗氧化、抗炎、增強機體免疫功能等多種藥理學(xué)作用［4-6］。本研究將采用92℃水浴18 s的方法制備30%TBSAⅢ度燒傷大鼠模型，觀察APS對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，并探討其可能的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑

黃芪多糖 （西安沃森生物科技有限公司，批號：20140627）；地塞米松磷酸鈉注射液（焦作福瑞堂制藥有限公司，規(guī)格：1 mL∶5 mg）；乳酸鈉林格注射液（河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司）；SOD、GSH-Px、CAT、MPO、T-AOC、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AST、CPK、LDH、cTnT試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒（BlueGene公司生產(chǎn)，編號E02N0011）。

1.2實驗動物

清潔級Wistar大鼠（雄性，8周齡，200～240 g），購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。動物合格證號：201504027（BlueGene公司生產(chǎn)，編號E02N0011）。

1.3主要儀器

UV-1200紫外-可見光分光光度計 （上海美譜達(dá)儀器有限公司）；BS-200全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；RM-2135型石蠟切片機（德國Leica公司）；iMark型酶標(biāo)儀（美國 Bio-Rad公司）。

1.4分組與造模

將120只實驗用大鼠隨機分為：假燒傷組，模型組，APS高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg）組和地塞米松（5 mg/kg）組，每組20只。參照黃躍生［7］報道的實驗方法制備30%TBSAⅢ度燒傷大鼠模型：腹腔注射烏拉坦實施麻醉，經(jīng)10%硫化鈉脫毛24 h后，于92℃恒溫水浴18s復(fù)制30%TBSAⅢ度燒傷（經(jīng)病理切片證實）；假燒傷組大鼠行麻醉、脫毛，然后于37℃恒溫水浴18 s。造模完成后，各組大鼠均立即腹腔注射乳酸林格液（40 mg/kg）進行復(fù)蘇；復(fù)蘇的同時腹腔注射給藥進行治療，假手術(shù)組和模型對照組則分別給予等體積0.9%氯化鈉注射液；給藥治療24 h后取材，檢測各指標(biāo)。

1.5標(biāo)本采集與檢測

1.5.1血清中心肌酶和cTnT含量的測定腹腔注射烏拉坦實施麻醉后，開腹經(jīng)腹主動脈取血，1500 r/min離心10 min后取血清，按照各試劑盒操作方法步驟，通過生化分析儀平行測定各組大鼠血清中AST、CPK、LDH、cTnT含量。

1.5.2觀察心肌組織病理性形態(tài)學(xué)變化待“1.5.1”取血完成后，開胸取心肌組織，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片和展片處理后，行常規(guī)HE染色，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠心肌組織病理性形態(tài)學(xué)變化。1.5.3心肌組織中抗氧化酶活性的測定取心肌組織，沖洗干凈后剪碎，加入適量冷裂解液并進行研磨勻漿，3000 r/min離心10 min后取上層清液，按照各試劑盒操作方法逐步進行處理后，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠心肌組織中SOD、CAT、GSHPx、MPO活性。

1.5.4血清中T-AOC水平和MDA含量的測定取“1.5.1”所制備的血清，按照各試劑盒操作方法逐步進行處理后，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠血清中T-AOC水平和MDA含量。

1.5.5血清中炎癥細(xì)胞因子含量的測定取“1.5.1”所制備的血清，按照ELISA試劑盒操作方法，逐步進行包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)處理后，通過酶標(biāo)儀平行測定各組大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10含量水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

表1　各組大鼠血清中心肌酶和cTnT含量的比較（±s）

表1　各組大鼠血清中心肌酶和cTnT含量的比較（±s）

與假燒傷組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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2.1各組大鼠血清中心肌酶和cTnT含量的比較

見表1。模型組大鼠血清中AST、CPK、LDH、cTnT含量較假燒傷組均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APS（200、400 mg/kg）治療24h能夠顯著降低嚴(yán)重?zé)齻笫笱逯蠥ST、CPK、LDH、cTnT含量 （P< 0.05或P<0.01）。

2.2各組大鼠心肌組織病理性形態(tài)學(xué)變化的比較

見圖1。觀察并比較各組大鼠心肌組織病理切片發(fā)現(xiàn)：假燒傷組大鼠未見異常，模型組大鼠心肌組織呈現(xiàn)心肌纖維排列紊亂、斷裂，毛細(xì)血管充血，心肌細(xì)胞腫脹等病理性形態(tài)學(xué)變化；APS各組心肌組織病理性形態(tài)學(xué)變化明顯好轉(zhuǎn)，以APS高劑量（400 mg/kg）組效果最為顯著。

圖1　各組大鼠心肌組織病理性形態(tài)學(xué)變化的比較（HE染色，×200）

2.3各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性的比較

見表2。模型組大鼠心肌組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT、MPO）活性較假燒傷組顯著降低 （P< 0.01）；與模型組比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APS（200、400 mg/kg）治療24 h能夠顯著升高嚴(yán)重?zé)齻笫骃OD、CAT活性，其中APS高劑量（400 mg/kg）組GSH-Px、MPO活性顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表2　各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性比較（±s）

表2　各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性比較（±s）

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2.4各組大鼠血清中T-AOC水平和MDA含量的比較

見表3。模型組大鼠血清中T-AOC水平顯著降低且而MDA含量顯著升高 （P<0.01）；經(jīng)APS（200、400 mg/kg）治療24 h能夠顯著降低嚴(yán)重?zé)齻笫笱逯蠱DA含量（P<0.05或P<0.01），其中高劑量（400 mg/kg）組T-AOC水平顯著升高（P<0.01）。

2.5各組大鼠血清中炎癥因子含量的比較

見表4。模型組大鼠血清中炎癥因子（CRP、TNF-α、IL-1、IL-6）含量顯著升高、IL-10含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APS（200、400 mg/kg）治療24 h能夠顯著降低嚴(yán)重?zé)齻笫笱逯蠧RP、TNF-α、IL-6含量（P< 0.05或P<0.01），其中高劑量（400 mg/kg）組IL-10含量顯著升高（P<0.05）。

表3　各組大鼠血清中T-AOC水平和MDA含量比較（±s）

表3　各組大鼠血清中T-AOC水平和MDA含量比較（±s）

組　別　n　T-AOC（U/L）　MDA（mmol/L）假燒傷組　20　16.8±3.2　5.6±1.3模型組　20　9.4±2.6**　11.7±2.0**APS低劑量組　20　9.9±2.7　10.3±2.4 APS中劑量組　20　10.5±3.0　9.2±1.8△APS高劑量組　20　13.1±3.4△△　7.5±1.6△△地塞米松組　20　9.8±2.6　9.6±1.7△

表4　各組大鼠血清中炎癥因子含量比較（±s）

表4　各組大鼠血清中炎癥因子含量比較（±s）

組別　n假燒傷組　20模型組　20 APS低劑量組　20 CRP（mg/L）TNF-α（μg/L）IL-1（pg/mL）4.7±1.9　0.99±0.28　109.5±9.7 20.3±4.6**　2.07±0.46**　167.3±15.2**19.0±5.2　1.89±0.45　152.8±17.6 APS中劑量組　20　16.7±4.3△　1.56±0.38△△　140.3±15.9△APS高劑量組　20　13.5±4.0△△1.39±0.42△△　134.9±15.4△地塞米松組　20　11.9±3.6△△1.15±0.33△△　117.6±10.8△△IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）76.9±15.2　42.9±7.3 218.3±24.7**　26.5±5.1**204.5±29.6　28.3±6.4 176.3±28.0△　30.9±6.0 145.1±23.6△△　34.2±7.5△92.8±17.5△△　38.0±7.1△△

3　討　論

燒傷患者往往并發(fā)心肌組織損傷，并且由于心臟體內(nèi)循環(huán)為動力器官，重度燒傷10 min后心輸出量即下降50%以上，60 min后心輸出量將不足1/3，所以由燒傷所引發(fā)的心肌損傷不僅可引起心功能不全，還可能導(dǎo)致或加重其他組織器官損傷，甚至誘發(fā)休克［1］。近年來，有研究表明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是燒傷所致心肌損傷的重要病理機制通路，這也為我們研發(fā)減輕燒傷損傷的新型藥物提供了新的思路。

體內(nèi)氧自由基（ROS）過剩是導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ)。正常狀態(tài)下，體內(nèi)ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡；首先，ROS在SOD催化作用下還原生成H2O2［8］，并在GSH-Px或CAT的催化作用下進一步還原生成對人體無害的H2O和O2［9-10］；MPO是中性粒細(xì)胞特有的酶，其活性也能夠反映機體抗氧化能力［11］，所以血清中SOD、GSH-Px、CAT及MPO共同構(gòu)成了機體的抗氧化防御系統(tǒng)，其活性能夠反映機體抗氧化能力；血清中T-AOC水平能夠反映機體整體抗氧化能力，而血清中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量水平也能夠間接反應(yīng)機體氧化應(yīng)激損傷程度［12］。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與燒傷所引發(fā)的心肌損傷密切相關(guān)［13］，血清中炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10含量水平的檢測是臨床上監(jiān)測炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，炎癥反應(yīng)發(fā)生后，血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量將顯著升高而IL-10含量顯著降低。黃芪多糖（APS）是中藥黃芪的主要活性成分之一。李紅法等［4］研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠通過改善機體抗氧化酶活性、提高自由基清除能力而表現(xiàn)出抗氧化作用；李承德等［5］研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子水平而表現(xiàn)出抗炎作用。而張家平等［2］和劉晟等［3］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是燒傷所致心肌損傷的重要病理機制通路，因此APS對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能具有抑制作用。本研究采用92℃水浴18 s的方法制備的30%TBSAⅢ度燒傷模型大鼠進行研究發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，APS治療組大鼠心肌組織病變顯著減輕，血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量和cTnT含量顯著降低，心肌組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT、MPO）活性顯著升高，血清中T-AOC水平顯著升高且MDA含量顯著降低；血清中炎癥細(xì)胞因子（CRP、TNF-α、IL-1、IL-6）含量顯著降低，IL-10含量顯著升高。結(jié)果提示APS對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有抑制作用，而表現(xiàn)出對嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織的保護作用［14-15］；其作用機制可能與APS能夠有效改善抗氧化酶活性、抑制氧化應(yīng)激損傷以及調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

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The Effects of Astraglus Polysaccharides on Oxidative Stress and Inflammatory Responses in Severely Burned Rats

GONG Wenyi，HAN Dong. Cangzhou Central Hospital，Hebei，Cangzhou 061001，China.

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-1005-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.017

河北省滄州市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（151302166）

△（電子郵箱：czhjlw@163.com）

（2015-11-20）