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        2型糖尿病大鼠心肌纖維化氣虛痰瘀證模型的建立*

        2016-08-31 06:55:00潘繼興鄧文祥曾光李亮陳青揚吳華英劉平安何軍鋒黃惠勇湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南長沙40208湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室湖南長沙40007
        中國中醫(yī)急癥 2016年6期
        關(guān)鍵詞:羥脯氨酸高糖高脂

        潘繼興鄧文祥曾 光李 亮陳青揚吳華英  劉平安  何軍鋒 黃惠勇,2△(.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 40208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室,湖南 長沙 40007)

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        2型糖尿病大鼠心肌纖維化氣虛痰瘀證模型的建立*

        潘繼興1鄧文祥1曾光1李亮1陳青揚1
        吳華英1劉平安1何軍鋒1黃惠勇1,2△
        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410007)

        目的 制備模擬人類發(fā)病過程的大鼠2型糖尿病心肌纖維化氣虛痰瘀證模型。方法 用雄性5周齡SD大鼠40只,隨機分為正常對照組8只、高糖高脂組8只、模型組24只,高糖高脂喂養(yǎng)4周造成胰島素抵抗后,正常對照組和高糖高脂對照組分組予以普食和高糖高脂飼料喂養(yǎng)。模型組于第5周予以腹腔注射2次1%小劑量STZ,2次之間間隔48 h,糖尿病造模成功后,隨機繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)22周。通過心肌病理Masson染色、免疫組織化學(xué)染色測定CollagenⅠ、CollagenⅢ和β-actin,氯胺T法測定羥脯氨酸表達。結(jié)果 模型組心肌病理切片及免疫組化結(jié)果顯示存在心肌纖維化,正常組和高糖高脂組幾乎沒有;模型組TG、TC、LDL的值高于正常組;模型組和高糖高脂組胰島素水平高于正常組;模型組脂聯(lián)素水平低于正常組和高糖高脂組;模型組IL-1、TNF-α高于正常組和高糖高脂組;模型組羥脯氨酸、NTpro-BNP高于正常組和高糖高脂組。糖尿病大鼠在高糖高脂喂養(yǎng)8、12、16周,逐漸有血脂升高的趨勢,開始出現(xiàn)高脂血癥,NT-proBNp和羥脯氨酸逐漸升高,但心肌Masson染色顯示心肌纖維化不明顯,20周的病理切片顯示心肌纖維化開始明顯,隨著高糖高脂喂養(yǎng)時間越久糖尿病大鼠精神狀態(tài)越差,飲食減少、體力活動量逐漸減少,趨向死亡的數(shù)量增加。結(jié)論造模成功后,大鼠的病理因素有痰和瘀,病位在脾和腎,證明2型糖尿病心肌纖維化氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)證模型成立。

        糖尿病糖尿病心肌病糖尿病心肌纖維化

        【Abstract】Objective:To establish Qi-asthenia and phlegm-stasis model in type 2 diabetic rats with myocardial fibrosis to imitate Pathogenesis of human.Methods:40 5-week-old SD rats were randomly divided into the control group(n=8),high-sugar and high-fat group(n=8),and the model group(n=24).High-sugar and high-fat group were fed for 4 weeks,causing insulin resistance.The control group and high-sugar and high-fat group were fed with normal food and high-sugar and high-fat food,respectively.In the fifth week,the model group received intraperitoneal injection with 1%low dose of STZ for twice,interval between two 48 h.After successful modeling of diabetes,they randomly continued to be fed with high-sugar and high-fat food for 22 weeks.Collagen I,Collagen III and α-actin were detected with Masson staining of Myocardial pathology and immunohistochemistry;Hydroxylproline was detected with Chloramine T method.Results:In the model group,the myocardial pathological sections and the results of immunohistochemistry showed that there was myocardial fibrosis,which,however,didn't exist in the control group and high-sugar and high-fat group.TG,TC and LDL in the model group was higher than that of the control group.The insulin level in the model group and high-sugar and high-fat group was higherthan that of the control group;adiponectin level in the model group was lower than that of the control group and high-sugar and high-fat group;IL-1,TNF-α in the model group was higher than that of the control group and high-sugar and high-fat group,as well as Hydroxylproline and NTpro-BNP.Diabetic rats were fed with high glucose and high fat for 8 w,12 w,and 16 w.There is a trend of increasing blood lipids;hyperlipidemia began to appear;NT-proBNp and Hydroxylproline gradually rose,but myocardial Masson staining showed no significant myocardial fibrosis.Pathological section in 20 th week showed significant myocardial fibrosis.The longer they were fed with high glucose and high fat,the worse the mental state of diabetic rats,with reduced diet,reduced physical activity,and increased number of deaths.Conclusion:From the point of view of traditional Chinese medicine,after the success of the model,the pathological factors of the rat have phlegm and blood stasis,and disease position lies in the spleen and kidney,which proves model establishment of the type 2 diabetic myocardial fibrosis of Qi and Yin deficiency,phlegm and blood stasis.

        【Key words】Diabetes;Diabetic cardiomyopathy;Diabetic myocardial fibrosis

        當(dāng)前,糖尿病心肌纖維化逐漸成為糖尿病患者致死、致殘的主要因素之一。尋求有效的防治方法是全球醫(yī)療面臨的挑戰(zhàn)性工作。糖尿病心肌纖維化是糖尿病患者常見的心血管并發(fā)癥,心肌間質(zhì)纖維化在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,是糖尿病心肌病的特征性病理表現(xiàn)[1]。根據(jù)糖尿病心肌纖維化造模建立困難,有關(guān)研究很滯后。少數(shù)2型糖尿病心肌纖維化模型造模意見不統(tǒng)一,造模成功率不可預(yù)見[2-4],且成功率低。筆者經(jīng)過多次嘗試大鼠2型糖尿病心肌纖維化造模,本實驗重點研究SD大鼠2型糖尿病心肌纖維化的建立及從中醫(yī)辨證角度探討其證型是否為氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)證模型?,F(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1實驗動物實驗動物為40只SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量140~160 g,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號 SYXK(湘)2013-0005;屏障環(huán)境:湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,許可證號SCXX(湘)2011-0003;合格證編號43004700012925。飼養(yǎng)處及實驗地:湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室,室溫(20±3)℃,相對濕度55%~70%,自由飲水,分籠飼養(yǎng)。

        1.2飼料配方1)高糖高脂飼料:60%kcal%Fat,規(guī)格為12.5 kg/箱,貨號為D12492,生產(chǎn)廠商為Research Diets;保存溫度為2~6℃。2)普通飼料:實驗鼠全價飼料,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心制作提供。成分:玉米粉53%、豆餅粉24%、麥麩16%、魚粉5%、骨粉1%、食鹽1%,其他營養(yǎng)添加劑均按產(chǎn)品說明添加。所有飼料均進行高溫消毒與輻射照射處理。

        1.3試劑鏈脲佐菌素 (STZ)(美國Sigma公司,批號:MFCD00006607);總膽固醇(TC)測定試劑盒,三酰甘油(TG)測定試劑盒,低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒,糖化血清蛋白測定試劑盒,葡萄糖(Glu)測試盒,脂聯(lián)素(ADP)測試盒,胰島素(Insulin)測試盒,C反應(yīng)蛋白(CRP)測試盒(南京建成公司)。ELISA Kit for NTerminal Pro-Brain Natriuretic Peptide(NT-ProBNP)(優(yōu)爾生,批號:SEA485Ra)。羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成,A030-2)。Rat IL-6 ELISA kit(欣博盛,批號ERC003.96)。Rat TNF-α ELISA kit(批號ERC102a. 96)。Anti-Collagen I antibody(批號ab34710)。Anti-Collagen III antibody(批號ab7778)。Anti-Actin-α(貨號:bs-0189R,上海恪敏生物科技有限公司)。

        1.4方法5周齡雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量140~160 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按隨機數(shù)字表法分為正常組(n=8)、高糖高脂組(n=32),正常組予以普通飼料,高糖高脂組予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周。4周后留8只做高糖高脂組做對照,剩下24只大鼠完成糖尿病造模,腹腔注射1%小劑量STZ,注射劑量按25 mg/kg+體表面積,mg/(kg·m2)計算STZ劑量方法:體質(zhì)量≤200 g的部分按25 mg/kg計算STZ量,>200 g的部分按162.5 mg/m2[體質(zhì)量的表面積=大鼠體型系數(shù)(0.09)×體質(zhì)量2/3]計算STZ量,二者相加為1次STZ的注射用量,溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液中,pH值4.5。間隔48 h后,再按上述方案注射一次STZ。正常組予以2次腹腔注射等體積 0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液。最后一次注射STZ后的第6日,禁食12 h后,尾靜脈測空腹血糖(FBG)和隨機血糖,以2次空腹血糖>11.1 mmol/L和(或)餐后血糖>16.7 mmol/L,為2型糖尿病大鼠成模標準。造模成功率為87.5%,21只大鼠復(fù)制2型糖尿病模型[5]。將造模成功的2型糖尿病大鼠都繼續(xù)予以高糖高脂飲食喂養(yǎng)22周誘導(dǎo)糖尿病心肌纖維化模型[6-8]。

        1.5分組及給藥將造模成功的21只2型糖尿病大鼠及高糖高脂組8只都繼續(xù)予以高糖高脂飲食喂養(yǎng)22周,模型組可誘導(dǎo)糖尿病心肌纖維化模型,正常組普普通飼料喂養(yǎng)。正常組和高糖高脂組大鼠分別給予等體積滅菌用水灌胃。第6周末,死亡2只,被淘汰,18只空腹血糖≥11.1 mmol/L和(或)隨機血糖≥16.7 mmol/L,并繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)22周,所有均自由飲水,最終存活9只驗證為糖尿病心肌病組(其中自行死亡4只,分別于12周、18周、21周、22周死亡于肺部感染和糖尿病高滲性昏迷)。另外分別在第造模成功后第8周、12周、16周、20周取2只模型組大鼠(共8只)進行心肌Masson切片,采血測B型納尿肽(NT-proBNP)和羥脯氨酸判斷心肌有無心肌纖維化及纖維化程度,采血測血脂檢測是否有高脂血癥的發(fā)生,各組大鼠每天灌胃給藥1次,連續(xù)灌胃22周[9,10]。

        1.6動物處理及指標檢測第23周處理全部動物,腹腔采血,取心肌、主動脈弓、胰島。1)外觀特征:各組大鼠體質(zhì)量、進食量、飲水量、尿量、毛發(fā)變化情況、活動及精神狀態(tài)、墊料潮濕情況、大便等指標。2)血液指標:灌胃結(jié)束后,大鼠隔夜禁食12 h,次晨取血,行血脂4項、CRP、糖化血紅蛋白、糖化血清蛋白、血糖、ADP、胰島素、NT-proBNP、羥脯氨酸檢測。

        1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以(±s)表示,并對數(shù)據(jù)采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1處理后各組外觀特征各項指標比較見表1。結(jié)果為注射STZ后,模型組與正常組和高糖高脂組相比,大鼠活動量明顯減少,糖尿病模型成立后體質(zhì)量先穩(wěn)定后逐漸下降,日平均消耗飼料量、飲水量及尿量增多,墊料具有甜膩氣味,喜溜邊、扎堆,毛發(fā)變黃、易脫落,精神萎靡,尾部潮濕,模型組與正常組和高糖高脂組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

        表1 各組處理后外觀特征各項指標比較

        2.2各組糖代謝、脂代謝指標比較見表2。檢測結(jié)果顯示,成模時與正常組比較,各組大鼠 FPG均明顯升高(P<0.05);模型組TG、TC、LDLC水平較高糖高脂組明顯增高(P<0.05)。

        表2 各組TC、TG、HDL、LDLC、CRP、FBG、糖化血清蛋白比較(mmol/L,±s)

        表2 各組TC、TG、HDL、LDLC、CRP、FBG、糖化血清蛋白比較(mmol/L,±s)

        組別 n TC TG HDL LDLC CRP FBG  糖化血清蛋白正常組 8高糖高脂組 8 1.77±0.22 0.55±0.14 1.41±0.29 1.69±0.20 0.51±0.071.52±0.38 0.31±0.52 0.29±0.11 0.91±0.57 0.75±0.75 12.38±3.76 145.80±19.60 8.58±5.50 129.00±19.92模型組 91.98±0.39*△2.94±1.69*△0.99±0.240.39±0.23*△1.71±0.57*△29.87±1.39*△223.50±17.97*△

        2.3各組胰島素、ADP、NT-proBNP、IL-6、TNF-α水平變化情況比較見表3。結(jié)果為模型組與高糖高脂組各組胰島素均大于0,且高于正常組(P<0.05),符合2型糖尿病模型,說明糖尿病大鼠存在胰島素抵抗[11-12];模型組的ADP、IL-6、羥脯氨酸水平低于其他組,胰島素、NT-proBNP高于正常組(P<0.05)。

        表3 各組胰島素、ADP、NT-proBNP、IL-6、TNF-α、羥脯氨酸檢測結(jié)果比較(±s)

        表3 各組胰島素、ADP、NT-proBNP、IL-6、TNF-α、羥脯氨酸檢測結(jié)果比較(±s)

        組 別 n 胰島素(IU/mL)ADP (mg/mL)NT-proBNP (ng/mL)IL-6 (pg/mL)TNF-α (pg/mL)羥脯氨酸(μg/mL)正常組 8高糖高脂組 8 19.81±3.15 3.46±0.65 0.19±0.90 26.87±0.51 3.58±0.62 0.20±0.23 52.51±6.89 53.28±1.33 14.80±10.81 22.12±4.87 11.47±8.57 5.63±3.93模型組 925.85±4.10*△7.61±0.33*△0.27±0.11*△68.86±9.83*△31.97±0.53*△15.30±9.09*△

        2.4各組心肌切片Masson染色結(jié)果比較見圖1。結(jié)果示正常組和高糖高脂組心肌纖維走行正常,心肌細胞核呈圓形或橢圓形,居細胞中央,心肌間質(zhì)及微血管結(jié)構(gòu)正常。STZ+高糖高脂組組:心室細胞輕度腫脹,心肌纖維及心室結(jié)構(gòu)排列紊亂,膠原沉積,橫紋不清。Masson染色,STZ+高糖高脂組藍顏色范圍大于正常組與高糖高脂組,提示心肌纖維化程度高于正常組與高糖高脂組。

        圖1 大鼠左室心肌心肌組織Masson染色切片(×400)

        2.5各組心肌免疫組化結(jié)果見圖2~4。結(jié)果為模型組的college1和college3高于正常組;α-肌動蛋白低于正常組,符合心肌纖維化的診斷[13-14]。

        圖2 各組α-肌動蛋白比較(×200)

        圖3 各組Collagen1比較(×200)

        圖4 各組Collagen3比較(×200)

        3 結(jié) 論

        筆者通過采用高脂高糖膳食喂養(yǎng)1周后,采用腹腔注射STZ復(fù)制糖尿病大鼠模型,在糖尿病模型基礎(chǔ)上再繼續(xù)高糖高脂組喂養(yǎng)22周,糖尿病大鼠明顯表現(xiàn)有高血糖、血脂紊亂、高胰島素血癥、胰島素敏感性下降、心肌纖維化、脂聯(lián)素水平降低、IL-6、TNF-α、NT-proBNP、羥脯氨酸升高,表明2型糖尿病心肌纖維化的模型成立。

        結(jié)果模型組心肌病理切片及免疫組化結(jié)果顯示存在心肌纖維化,正常組和高糖高脂組幾乎沒有;模型組TG、TC、HDLC的值高于正常組,LDLC低于正常組和高糖高脂組;模型組和高糖高脂組胰島素水平高于正常組,說明模型組存在高胰島素血癥,存在胰島素抵抗;模型組脂聯(lián)素水平低于正常組和高糖高脂組;模型組IL-6、TNF-α高于正常組和高糖高脂組;模型組羥脯氨酸、NTpro-BNP高于正常組和高糖高脂組,也說明模型組的心肌纖維化的指標升高,心肌受損。糖尿病大鼠在高糖高脂喂養(yǎng)8周、12周、16周,逐漸有血脂升高的趨勢,開始出現(xiàn)高脂血癥,NT-proBNp和羥脯氨酸逐漸升高,但心肌Masson染色顯示心肌纖維化不明顯,20周的病理切片顯示心肌纖維化開始明顯,隨著高糖高脂喂養(yǎng)時間越久糖尿病大鼠精神狀態(tài)越差,飲食減少、體力活動量逐漸減少,趨向死亡的數(shù)量增加。

        造模成功后,糖尿病心肌纖維化大鼠有多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕的及少動懶動、精神萎靡、抱團扎堆、毛發(fā)發(fā)黃、粗糙、掉毛的表現(xiàn),符合中醫(yī)“氣陰虧虛證”的表現(xiàn)[15];大鼠形體肥胖,舌質(zhì)胖大,舌苔可見痰,高血脂、高胰島素血癥、低脂聯(lián)素水平符合中醫(yī)的“痰證”的表現(xiàn);其舌色、爪色比正常組大鼠要深,呈淡紫色,心肌纖維化,符合中醫(yī)的“瘀證”的表現(xiàn)。從中醫(yī)的角度推之,造模成功后,大鼠的病理因素有痰和瘀,病位在脾和腎,證明2型糖尿病心肌纖維化氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)證模型成立。

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        Establishment of Qi-asthenia and Phlegm-stasis Model in Type 2 Diabetic Rats with Myocardial Fibrosis

        PAN Jixing,DENG Wenxiang,ZENG Guang,et al.Hunan University of Chinese Medicine,Hunan,Changsha 410208,China.

        R285.5文獻標志碼:A

        1004-745X(2016)06-0953-04

        10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.004

        國家自然科學(xué)基金面上項目(81373551);教育部博士點博士導(dǎo)師課題(20134323110001);湖南省科技廳社會發(fā)展支撐計劃重點項目(2014S2032);湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(2014153);湖南省研究生創(chuàng)新課題 (CX2015B332),中醫(yī)診斷學(xué)國家重點學(xué)科建設(shè)項目 (2013ZYZD04,2014-5,2014-28,ZYZD2015B32);湖南省學(xué)位與研究教育教學(xué)改革研究課題(JG2015B068)

        △(電子郵箱:huanghy68@126.com)

        (2015-08-09)

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