徐麗瑤 王勇 劉琴 羅輝 鐘小軍 李勇

肺癌是嚴重危害人類健康的疾病，據(jù)美國癌癥學會2011年公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，肺癌的發(fā)病率（160萬/年）及死亡率（140萬/年）均居全球癌癥首位[1]。放療是肺癌最重要的治療手段之一，其機制主要是通過放療射線引起DNA損傷[2]。由于腫瘤細胞具有較強的DNA損傷修復能力，嚴重限制了肺癌放射治療的效果。DNA損傷主要通過同源重組修復（homologous recombination, HR）和非同源末端連接 （nonhomologous end joining, NHEJ）兩種方式進行修復。其中Rad51是HR修復的關(guān)鍵分子[3]，而Ku70/80是啟動和調(diào)節(jié)NHEJ的關(guān)鍵因子[4]，其中任一組分的表達改變或功能缺失，都可能改變DNA損傷修復效率。

最近，有研究[5-7]報道自噬可影響DNA損傷修復過程。自噬是真核細胞中常見的自我消化現(xiàn)象，在大部分腫瘤細胞中，自噬處于較低的基礎(chǔ)水平，一旦處于應激狀態(tài)下（如缺氧、能量不足、放療射線），自噬水平可能急劇上調(diào)[8,9]。為了探究自噬是否影響肺癌A549細胞的放療敏感性，其分子機制是否可能與DNA損傷修復過程相關(guān)，本研究采用雷帕霉素（rapamycin, RAPA）上調(diào)A549細胞自噬水平，觀察自噬活化時，放療射線對A549細胞存活和增殖活性的影響，以及DNA損傷修復水平的改變，明確是否可以通過雷帕霉素調(diào)控自噬進而影響肺癌A549細胞的放療敏感性，并初步分析DNA損傷修復過程是否與其相關(guān)，以探討通過調(diào)控自噬增強局部放射治療效果的可能性，為提高肺癌患者的治療效果及遠期生存率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清（Hyclone），蛋白質(zhì)提取試劑盒（Pierce公司），PCR儀（ABI），LC3抗體（Sigma），p62抗體（BD bioscience），γ-H2AX抗體（Abcam公司），Rad51抗體、Ku70/80抗體（CST），Trizol（Transgene），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR試劑盒（Takara），蛋白質(zhì)電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad），直線加速器（西門子）。

1.2 細胞培養(yǎng)、照射方式及實驗分組

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細胞（購于中科院上海細胞庫），用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 照射方式 照射條件：室溫條件下采用6 MV X線照射細胞，培養(yǎng)皿上方墊1.5 cm有機玻璃板。源皮距為100 cm，照射劑量為4 Gy（劑量率為200 cGy/min），每個實驗組設(shè)置3個平行樣本。

1.2.3 實驗分組 本研究設(shè)①對照組；②單純放療組；③放療+RAPA組。取生長狀態(tài)良好的A549細胞經(jīng)0.25%胰酶消化，待細胞生長密度約70%-80%時，對照組不經(jīng)任何處理，單純放療組加入DMSO，放療+RAPA組加入100 nM RAPA后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，單純放療組及放療+RAPA組行4 Gy放療射線照射。

1.3 電鏡下觀察自噬體的變化 采用不含EDTA的胰酶消化細胞，PBS洗3次，加入新配的4%多聚甲醛，4 ℃過夜。經(jīng)餓酸進一步固定、系列丙酮脫水、浸透、包埋、超薄切片、染色后于透射電鏡下觀察自噬體形成情況。

1.4 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達 冷PBS洗2次，加入細胞裂解液于4 ℃裂解20 min，13,000 g離心20 min，收集上清，提取細胞總蛋白質(zhì)，BCA法測蛋白質(zhì)濃度。取20 μg樣品煮沸變性后進行Tricine-SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗37 ℃孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值，以目的條帶與β-actin調(diào)對灰度比值來表示蛋白質(zhì)相對表達量[10,11]。

1.5 細胞克隆形成實驗檢測放療對A549細胞增殖的影響放療后經(jīng)胰酶消化，收集細胞后，經(jīng)細胞計數(shù)，將細胞接種于含5 mL預溫37 ℃培養(yǎng)基的60 mm培養(yǎng)皿中，以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻。常規(guī)培養(yǎng)2周后，終止培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色。根據(jù)以下公式計算克隆形成率及細胞存活分數(shù)：克隆形成率（plating efficiency,PE）=（每組平均集落數(shù)／每皿接種的細胞數(shù)）×100%，細胞存活分數(shù)（survival fraction, SF）=（實驗組集落形成率／對照組集落形成率）×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素調(diào)控自噬影響A549細胞的放療敏感性 電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，與單純放療組相比，雷帕霉素聯(lián)合放療組自噬小體形成增加（圖1A）。此外，我們還通過Western blot檢測自噬底物蛋白質(zhì)p62及自噬標志性蛋白質(zhì)LC3表達。經(jīng)圖像半定量分析灰度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，放療組LC3II/LC3I表達增加為（4.1±0.29）倍，p62表達減少為（0.83±0.12），放療聯(lián)合雷帕霉素組LC3II表達增加為（5.8±0.32），p62表達減少為（0.42±0.06），（圖1B，圖1C）（P＜0.05）。通過克隆形成實驗，我們還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單純放療組SF減少為（0.61±0.12），放療聯(lián)合雷帕霉素組SF減少為（0.37±0.04）（圖1D）（P＜0.05）。

2.2 雷帕霉素通過調(diào)控自噬影響A549細胞放療敏感性的機制 γ-H2AX為DNA損傷標志性分子，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，放療后1 h，與對照組相比，單純放療組γ-H2AX蛋白質(zhì)表達增加為（9.6±0.21），放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX蛋白質(zhì)表達增加為（10.8±0.17）（P＜0.05），單純放療組與放療聯(lián)合雷帕霉素組之間無統(tǒng)計學差異；放療后24 h單純放療組γ-H2AX蛋白質(zhì)表達下調(diào)為（1.8±0.04），放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX蛋白質(zhì)表達下調(diào)為（4.3±0.07）（P＜0.05）（圖2A，圖2B）。

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，放療組Rad51蛋白質(zhì)表達增加為（1.2±0.04）（P＜0.05），Ku70蛋白質(zhì)、Ku80蛋白質(zhì)表達無明顯變化，放療聯(lián)合雷帕霉素組Rad51蛋白質(zhì)表達減少為（0.4±0.03），Ku80蛋白質(zhì)表達減少為（0.3±0.08）（P＜0.05），Ku70無明顯變化（圖2C，圖2D）。

3 討論

DNA損傷修復系統(tǒng)在維護基因組的完整與穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用，腫瘤細胞的DNA損傷修復是最終導致放射性抵抗的罪魁禍首，極大地影響了肺癌放射治療的效果。有研究[12]表明，干預DNA修復路徑將削弱腫瘤細胞基因組的穩(wěn)定，造成腫瘤細胞基因片段的缺失、遺傳突變、甚至細胞的死亡。但是，目前有關(guān)于自噬與放療敏感性的研究大多關(guān)注于通過調(diào)控自噬上游通路影響放療敏感性，而自噬對肺癌放療后DNA損傷修復的影響及其相關(guān)分子機制的研究甚少。因此，了解自噬是通過何種途徑促進放療后細胞死亡，可為放射治療提供新的切入點和思路，對逆轉(zhuǎn)肺癌的放療抵抗治療具有重要意義[13]。

圖1 Rapamycin通過誘導自噬增加放療敏感性。A：A549細胞給予Rapamycin（100 nM）預處理24 h，放療（4 Gy）后4 h收集細胞，采用電鏡（10,000×）檢測自噬體。A：a：正常組；b：IR組；c：IR+RAPA組。B：采用Western blot檢測Rapamycin（100 nM）預處理24 h，放療（4 Gy）后4 h LC3蛋白質(zhì)、p62蛋白質(zhì)表達變化。C：QuanlityOne軟件進行半定量分析，LC3蛋白質(zhì)、p62蛋白質(zhì)表達倍數(shù)變化。D：細胞克隆形成實驗檢測Rapamycin（100 nM）預處理24 h，放療后A549細胞增殖情況。與N組相比，*P＜0.05，與IR組相比，△P＜0.05。Fig 1 Rapamycin sensitized radiation by induced autophagy.A: A549 cells were incubated with 100 nmol/L rapamycin for 24 h before exposure to 4 Gy of irradiation, cells were extracted at 4 h after irradiation, autophagosomes were observed under transmission electron microscope(10,000×).A: a: Control group; b: IR group; c: IR+RAPA group.B: A549 cells were incubated with 100 nmol/L rapamycin for 24 h before exposure to 4 Gy of irradiation, proteins were extracted at 4 h after irradiation, LC3II/I and p62 expression were detected by Western blot analysis.C: Semiquantitated of LC3II/I and p62 expression using QuanlityOne software.D: The survival fraction of rapamycin-treated A549 cells for 24 h after exposure IR were analyzed by clonogenic assay.*P＜0.05 vs Control group, △P＜0.05 vs IR group.

圖2 Rapamycin通過自噬抑制DNA損傷修復，增加放療敏感性。A：A549細胞給予Rapamycin（100 nM）預處理24 h，放療（4 Gy）后1 h、24 h收集細胞，采用Western blot檢測γ-H2AX蛋白質(zhì)表達變化。B：QuanlityOne軟件進行半定量分析，γ-H2AX蛋白質(zhì)表達倍數(shù)變化。與N組相比，*P＜0.05。與1 h相比，▲P＜0.05；與IR組相比，△P＜0.05。C：處理同前，于放療后4 h收集細胞，采用Western blot檢測Rad51蛋白質(zhì)、Ku70/80蛋白質(zhì)表達。D：QuanlityOne軟件進行半定量分析，Rad51、Ku70蛋白質(zhì)表達變化。與N組相比，*P＜0.05；與IR組相比，△P＜0.05。Fig 2 Rapamycin sensitized radiation by autophagy inhibited the process of DNA damage repair.A: A549 cells were incubated with 100 nmol/L rapamycin for 24 h before exposure to 4 Gy of irradiation, proteins were extracted at 4 h after irradiation, γ-H2AX expression were detected by western blot analysis.B: Semi-quantitated of γ-H2AX expression using QuanlityOne software.*P＜0.05 vs Control group, ▲P＜0.05 vs 1 h, △P＜0.05 vs IR group.C: Treated as before, cells were extracted at 4 h after irradiation, LC3II/I and p62 expression were detected by western blot analysis.D:Semi-quantitated of Rad51 and Ku70 expression using QuanlityOne software.*P＜0.05 vs Control group, △P＜0.05 vs IR group.

本研究選取人肺腺癌A549細胞作為研究對象，我們前期已通過MTT實驗觀察了不同濃度雷帕霉素在不同作用時間對A549細胞增殖的影響，結(jié)合相關(guān)文獻[14-16]報道，最終選用100 nmol/L劑量濃度的雷帕霉素作用A549細胞24 h，僅有10% A549細胞生長受抑制，最大限度減少了雷帕霉素藥物本身對A549細胞的殺傷作用，以利于本項目觀察雷帕霉素對A549細胞的放療增敏作用。p62為自噬底物，自噬發(fā)生時，p62表達減少；而LC3存在兩種形式，LC3I和LC3II，前體LC3合成后經(jīng)加工形成LC3I，后者與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3II，當自噬形成時，LC3I減少而LC3II增加。透射電鏡是檢測自噬的金標準。我們通過Western blot及電鏡發(fā)現(xiàn)放療射線可誘導A549細胞自噬發(fā)生，且雷帕霉素可進一步上調(diào)放療所誘導的自噬?？寺⌒纬蓪嶒炞C實雷帕霉素聯(lián)合放療后SF值較單純放療組下降。以上結(jié)果表明通過雷帕霉素上調(diào)人肺腺癌A549細胞自噬水平，可促進放療后A549細胞死亡，增加其放療敏感性，減少其放療抵抗，具有放療增敏作用。

自噬聯(lián)合放療有望成為肺癌治療的新策略，放射治療的敏感性主要與放療后細胞DNA損傷的修復程度相關(guān)，目前，少量研究報道，自噬可影響細胞DNA損傷修復過程，Robert等[6]在酵母中發(fā)現(xiàn)，自噬通過降解乙?；腄SBs修復酶ctlp、Exo1，阻斷HR修復途徑。然而，自噬是否可通過影響DNA損傷修復過程增加肺癌的放療敏感性，目前尚不明確。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，放療后1 h，與對照組相比，放療組及放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX蛋白質(zhì)（DNA損傷標志分子）表達上調(diào)，但兩組之間無明顯差異，放療后24 h，單純放療組及放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX蛋白質(zhì)（DNA損傷標志分子）表達下調(diào)，且單純放療組減少更明顯。放療射線可誘導A549細胞DNA損傷，但由于A549細胞具有較強的DNA損傷修復能力，限制了放療射線對A549細胞的殺傷作用，同時給予雷帕霉素處理，雖并未明顯增加放療后A549細胞DNA損傷，然γ-H2AX持續(xù)存在，DSBs未得到正確有效的修復，損傷DNA的數(shù)量增加，從而增加腫瘤放射治療的有效性。

放療后DNA損傷修復主要依賴以下兩種途徑，HR修復和NHEJ修復[17]，其中HR修復是細胞發(fā)生DNA損傷后進行精確修復的主要機制，其具體機制十分復雜，涉及大量蛋白質(zhì)，最重要的是Rad51；而NHEJ修復則是細胞發(fā)生DNA損傷后進行修復的最為普遍機制，DNAPK是參與NHEJ途徑要的分子之一，DNA-PK由催化亞基DNA-PKCs和兩個調(diào)節(jié)亞基Ku70、Ku80組成，其中Ku70和Ku80作為輔助因子，在DNA損傷修復過程中發(fā)揮著重要作用，其功能可能較DNA-PKCs更為廣泛[18]。大量研究證實，哺乳動物細胞內(nèi)缺乏Rad51、Ku70、Ku80時，DSBs修復能力下降，細胞對放療的敏感性增加。Zhou等[19]的研究證實采用siRNA敲除E3泛素連接酶RNF8，可通過減少Rad51表達，進而增加肺腺癌A549細胞放療敏感性。Belenkov等[20]采用反義核苷酸技術(shù)減少Ku蛋白質(zhì)表達，減少DNA損傷修復，增加腦膠質(zhì)瘤細胞放療敏感性。Chen等[21]的研究還發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可減少Rad51蛋白質(zhì)至DNA損傷部位的聚集，從而起到放療增敏的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，采用雷帕霉素上調(diào)自噬增加放療敏感性的同時，放療后Rad51蛋白質(zhì)、Ku80蛋白質(zhì)表達較單純放療組下降，以上結(jié)果表明，通過雷帕霉素上調(diào)肺腺癌A549細胞自噬，可起到放療增敏的效果，鑒于雷帕霉素可影響Rad51及Ku80蛋白質(zhì)水平，我們推測，通過雷帕霉素上調(diào)自噬可促進放療射線對肺腺癌A549細胞的殺傷作用，增加放療敏感性，以上過程可能與DNA損傷修復的同源重組及非同源末端連接相關(guān)，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，在體外細胞實驗中，雷帕霉素可通過上調(diào)A549細胞自噬水平，促進DSBs修復相關(guān)蛋白質(zhì)降解，從而增加放療敏感性。提示自噬激活劑或可被用于肺癌的輔助治療，目前我們僅僅進行了體外研究，初步分析了自噬影響A549細胞放療敏感性的可能機制，但其深入的機制及作用尚有待更多的體內(nèi)外研究進行驗證。