張亞紅，劉重霄，周　任，師　蔚，郭振宇

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大鼠腦出血模型中血腦屏障開放規(guī)律及應(yīng)用腦血疏口服液治療腦水腫的實(shí)驗(yàn)研究

張亞紅，劉重霄，周任，師蔚，郭振宇

目的在建立大鼠腦出血(ICH)模型基礎(chǔ)上，通過觀察血腦屏障(BBB)開放規(guī)律及早期應(yīng)用藥物進(jìn)行干預(yù)，探討ICH后腦損傷的致病機(jī)制及治療方案。方法選用SD大鼠78只，隨機(jī)分為ICH組、治療組和對(duì)照組，各組又隨機(jī)分為1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亞組，ICH組、治療組注射Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，造模后進(jìn)行腦含水量及伊文氏蘭含量測(cè)定。結(jié)果ICH組：腦出血后早期(1 h)即有腦水腫出現(xiàn)，6 h至3 d腦水腫增加明顯，7 d后漸下降；治療組：腦水腫于3 d左右開始明顯增加，7 d后下降。腦出血后BBB變化：1 h腦出血組和治療組即有伊文氏蘭滲出，ICH組分別造模后6 h和3 d達(dá)到高峰；治療組于造模后6 h到達(dá)高峰。結(jié)論腦血疏口服液可以通過抑制BBB的開放，減輕腦水腫的發(fā)生、發(fā)展，從而減輕ICH后腦損傷。

腦出血；腦水腫；腦血疏口服液；血腦屏障；中風(fēng)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后腦內(nèi)血腫及其分解產(chǎn)物可引起腦組織繼發(fā)損傷，并產(chǎn)生一系列病理生理改變。研究表明：腦出血早期即有血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞并伴有血管源性腦水腫等繼發(fā)性腦損傷發(fā)生，而且隨著BBB的破壞及通透性增加，血液成分及其降解產(chǎn)物和炎性細(xì)胞大量滲入腦組織中，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和腦組織進(jìn)一步損傷[1]。那么ICH后BBB破壞具體時(shí)程如何，目前研究結(jié)果仍未有定論，故如何早期對(duì)BBB進(jìn)行干預(yù)，是國(guó)內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)心的熱點(diǎn)。近年的研究表明：腦血疏口服液具有益氣、活血、化瘀之功效，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其確實(shí)對(duì)ICH病人顱內(nèi)血腫吸收起到促進(jìn)作用[2]，但其確切治療機(jī)制仍未完全明了。本實(shí)驗(yàn)擬在建立大鼠ICH模型基礎(chǔ)上，觀察BBB開放規(guī)律及早期應(yīng)用腦血疏口服液進(jìn)行干預(yù)的效果，ICH后腦損傷的致病機(jī)制及治療方案。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組健康清潔SD大鼠78只，體重250 g～300 g，雄性，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用隨機(jī)數(shù)字表法分為ICH組、治療組和對(duì)照組。ICH組和治療組再隨機(jī)分為1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亞組，每亞組6只大鼠，對(duì)照組共6只大鼠，各組間動(dòng)物體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2ICH動(dòng)物模型建立用Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，大鼠術(shù)前12 h禁飲食4 h禁水，0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)，必要時(shí)水合氯醛補(bǔ)充麻醉，保證手術(shù)操作期間大鼠有自主呼吸，俯臥位固定于動(dòng)物頭顱立體定向儀上，頭皮“釘子型”剪開，取前囟為原點(diǎn)，向右3 mm，向后1 mm，深度5 mm為注射點(diǎn)(尾狀核)，磨鉆磨開顱骨，進(jìn)針后緩慢注射Ⅳ型膠原酶、肝素和生理鹽水混合溶液(每1 μL含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U)，留針10 min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。術(shù)中注意大鼠呼吸情況并保持呼吸道通暢，大鼠體溫控制在36.5 ℃～37.5 ℃，術(shù)畢動(dòng)物送入有空調(diào)的動(dòng)物房飼養(yǎng)。對(duì)照組按Ⅳ型膠原酶法注入相同劑量生理鹽水；治療組按上述造模方法每8 h灌服腦血疏口服液1 mL/kg，ICH組及對(duì)照組灌服生理鹽水。

1.3腦組織含水量測(cè)定(干濕重法)術(shù)后在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用過量的水合氯醛麻醉動(dòng)物，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動(dòng)脈根部，在右心耳剪開一小口當(dāng)作出口。4%多聚甲醛100 mL快速灌注，之后稍減慢灌注速度繼續(xù)固定，灌注約30 min至動(dòng)物四肢變硬，斷頭取腦，測(cè)濕重標(biāo)本，取ICH側(cè)皮質(zhì)針孔前組織，厚約3 mm腦組織測(cè)定濕重，然后將標(biāo)本放于95 ℃烘箱中烘干24 h再稱重，干濕重均由電子分析天平稱量。腦組織含水量按如下公式計(jì)算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%，干濕重均精確到0.1 mg。

1.4伊文氏蘭注射及標(biāo)本采集對(duì)照組注射2%伊文氏蘭3 mL/kg后24 h處死，ICH組和治療組于造模前1 h注射等量的伊文氏蘭。取腦前，用生理鹽水左心室灌注至右心耳流出清亮液體。橫斷面切取損傷平面厚約3 mm的腦組織，將其分為ICH側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和健側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下4個(gè)部分，分析天平上稱取其濕重，將各部分放入勻漿器勻漿，勻漿液為2 mL的50%三氯乙酸(TCA)，充分勻漿后，將組織勻漿液15 000 r/min離心20 min，在伊文氏蘭最大吸收光譜635 nm處檢測(cè)吸光度，從伊文氏繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得伊文氏蘭含量結(jié)果。

2　結(jié)　果

2.1ICH后大鼠腦組織含水量變化規(guī)律ICH組在造模后1 h即有腦組織含水量增加，但此時(shí)與治療組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；6 h時(shí)ICH組腦含水量較治療組和對(duì)照組增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但治療組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 d時(shí)ICH組含水量達(dá)到高峰，與治療組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且此時(shí)治療組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；7 d時(shí)ICH組腦含水量仍高于對(duì)照組和治療組(P<0.05)，但治療組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；14 d時(shí)ICH組與治療組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　ICH后腦組織水腫量變化(±s)　 %

2.2ICH后大鼠腦組織伊文氏蘭變化規(guī)律ICH后1 h腦出血組和治療組即有伊文氏蘭滲出，ICH組分別造模后6 h和3 d達(dá)到高峰；治療組于造模后6 h達(dá)高峰。詳見表2。

表2　ICH后大鼠腦組織伊文氏蘭變化(±s)　 μg/g

3　討　論

腦出血是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，ICH后繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致ICH病人致殘率和死亡率極高的重要原因之一。目前關(guān)于ICH后腦損傷的研究認(rèn)為損傷原因包括兩方面：一是原發(fā)性腦損傷或稱直接腦損傷，其損傷機(jī)制為ICH后神經(jīng)元胞體受到擠壓，軸突遭受撕扯、斷裂及ICH后神經(jīng)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)攝取方面障礙，從而導(dǎo)致相應(yīng)的腦損傷；二是繼發(fā)性腦損傷或稱間接腦損傷，其損傷機(jī)制包括血腫腔及周圍急性炎性反應(yīng)、血細(xì)胞的滲出及局部或全身免疫細(xì)胞的激活，并釋放大量的有害因子(如免疫因子、血紅蛋白)造成的腦損傷，同時(shí)有血腦屏障的破壞及腦水腫、腦腫脹的形成，最終引起腦疝致病人死亡[3]。有關(guān)繼發(fā)性腦損傷的研究證實(shí)：ICH后紅細(xì)胞成分血紅蛋白被釋放到腦組織或蛛網(wǎng)膜下腔中，其在代謝過程中產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致了神經(jīng)元細(xì)胞膜損傷、DNA片斷化和細(xì)胞凋亡[4-6]。目前研究認(rèn)為繼發(fā)性腦損傷在ICH后腦損傷中占有主導(dǎo)地位，而BBB的破壞又是繼發(fā)性腦損傷的中心環(huán)節(jié)[7]。

現(xiàn)階段對(duì)BBB開放規(guī)律及時(shí)間還尚未定論：Hartl等[8]在研究動(dòng)物腦皮質(zhì)損傷(cortical contusion injury，CCI)后認(rèn)為，BBB開放存在兩個(gè)高峰，BBB于腦損傷后1 h左右首次開放，于24 h達(dá)到第1次高峰，其后漸下降。第2次開放高峰形成于傷后第3天；Baskaya等[9]在研究腦外傷(traumatic brain injury，TBI)后提出：腦損傷后BBB兩次開放高峰分別形成于4 h～6 h和72 h，并且兩次BBB開放與外傷后原發(fā)和繼發(fā)性腦損傷是相對(duì)應(yīng)的，認(rèn)為腦外傷可以直接導(dǎo)致BBB 破壞即第1次開放高峰的到來，而第2次BBB開放高峰不僅使血細(xì)胞外滲，而且還有很多炎性因子也隨之滲出，這是炎性因子再次破壞BBB內(nèi)皮細(xì)胞的前提，也為第2次BBB 開放作了準(zhǔn)備。本次實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠ICH后腦組織含水量及檢測(cè)鼠腦組織中伊文氏蘭含量得出了與TBI后BBB開放規(guī)律類似的結(jié)論：ICH后早期(1 h～6 h)即有BBB開放并有腦水腫發(fā)生，至ICH后3 d左右BBB再次開放，同時(shí)到達(dá)水腫最高峰，7 d后水腫緩慢下降，14 d后基本恢復(fù)對(duì)照組水平。

腦血疏口服液具有益氣、活血、化瘀的作用，其主要成分為黃芪、水蛭、 石菖蒲、牛膝及川芎，主要用于氣虛血瘀所致中風(fēng)病人。近年來，腦血疏口服液廣泛應(yīng)用于出血性腦血管病的治療，療效肯定[10]。謝道珍等[2]研究結(jié)果顯示：將腦血疏口服液用于出血腦中風(fēng)病人后，其治療組總有效率高達(dá)87.74%。本次實(shí)驗(yàn)中，治療組應(yīng)用腦血疏口服液進(jìn)行干預(yù)后，BBB開放起始時(shí)間較ICH組延后，并且腦水腫程度明顯降低。現(xiàn)在對(duì)BBB相關(guān)研究較多集中在其破壞方式上，主要有兩種：其一是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷即細(xì)胞的壞死或凋亡；其二是細(xì)胞間緊密聯(lián)結(jié)的破壞[11]。那么腦血疏口服液是通過何種渠道對(duì)BBB進(jìn)行保護(hù)，這還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，腦血疏口服液可以減輕ICH后腦損傷的可能機(jī)制：通過抑制BBB的開放，減輕腦水腫的發(fā)生、發(fā)展，從而達(dá)到改善神經(jīng)功能的目的。

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(本文編輯郭懷印)

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710004)

郭振宇，E-mail：guozhenyu1818@sina.com

R741R289.5

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．015

1672-1349(2016)14-1613-03

2016-01-09)