張俊濤，劉志貞，劉　丹，張悅紅

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高糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響

張俊濤，劉志貞，劉丹，張悅紅

目的探討高糖環(huán)境是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。方法從C57大鼠海馬組織提取培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，分為3組：正常對(duì)照組、低糖組(5 mmol/L)、高糖組(50 mmol/L)，不同濃度葡萄糖作用48 h后，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 梯狀條帶、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有形成神經(jīng)球的能力，Nestin免疫熒光染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。瓊脂糖凝膠電泳顯示高糖組提取的DNA出現(xiàn)特征性梯狀條帶，正常對(duì)照組和低糖組未出現(xiàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(5.83±0.36)%，低糖組細(xì)胞凋亡率(6.25±0.52)%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組細(xì)胞凋亡率(20.97±1.21)%，與正常對(duì)照組和低糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。

神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；高糖；瓊脂糖凝膠電泳；Nestin免疫熒光染色

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或作用障礙所致的以血糖增高為特征的代謝性疾病，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致病人出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和癡呆等疾病[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人海馬組織可出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，并且萎縮程度與糖尿病病程相關(guān)；同時(shí)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在糖尿病大鼠模型海馬組織中發(fā)現(xiàn)大量凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞[2]，表明高糖環(huán)境引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡在糖尿病病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用。

神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)組織特異性的具有無(wú)限自我復(fù)制與更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的干細(xì)胞[3]。研究發(fā)現(xiàn)：成年哺乳動(dòng)物腦組織的海馬齒狀回和側(cè)腦室下層也存在神經(jīng)干細(xì)胞，并且可以分化為神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元及各類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[4]，但是由于成年哺乳動(dòng)物腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量有限，機(jī)體自身神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的效果并不明顯。隨著生物治療技術(shù)的開(kāi)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索神經(jīng)干細(xì)胞顱內(nèi)移植治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為傳統(tǒng)方法治療難以取得效果的疾病帶來(lái)希望。

糖尿病高糖環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞是否也會(huì)發(fā)生凋亡，影響神經(jīng)干細(xì)胞在高血糖病人腦內(nèi)存活率，降低神經(jīng)干細(xì)胞損傷修復(fù)的治療效果。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)高糖環(huán)境培養(yǎng)海馬組織神經(jīng)干細(xì)胞，運(yùn)用DNA ladder檢測(cè)凋亡小體，Annexin V/PI染色觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率，研究高糖環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料葡萄糖購(gòu)于Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27 購(gòu)自Gibco公司，EGF、bFGF購(gòu)自PeproTech公司，Nestin、NF-H、GFAP、GALC兔抗小鼠多克隆抗體購(gòu)于SANTA CRUZ公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔二抗、Cy3標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)于Invitrogen公司，DNA ladder檢測(cè)試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)取成年C57小鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)大腦組織分離海馬區(qū)域，采用機(jī)械消化法，反復(fù)吹打海馬組織直到呈單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，轉(zhuǎn)移至50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

1.2.2神經(jīng)干細(xì)胞鑒定將神經(jīng)干細(xì)胞球吸出轉(zhuǎn)移至6孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)2 h；0.01 mol/L PBS洗3次，4%多聚甲醛固定；0.1%Triton破膜；2%山羊血清封閉；0.01 mol/L PBS洗3次，加入兔抗Nestin多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；0.01 mol/L PBS洗3次，加入羊抗兔IgG-Cy3二抗，避光作用2 h；抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.3神經(jīng)干細(xì)胞分化與鑒定將神經(jīng)干細(xì)胞球吸出轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入神經(jīng)干細(xì)胞分化液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)1周，0.01 mol/L PBS洗3次，4%多聚甲醛固定；0.1%Triton破膜；2%山羊血清封閉；0.01 mol/L PBS洗3次，分別加入小鼠抗NF-H多克隆抗體、兔抗GFAP多克隆抗體、兔抗GALC多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；0.01 mol/L PBS洗3次，各孔中分別加入相應(yīng)熒光二抗：羊抗兔FITC標(biāo)記二抗或Cy3標(biāo)記羊抗兔二抗，避光作用2 h；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.3實(shí)驗(yàn)分組神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)鑒定后傳代至六孔板37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h用于實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察高糖環(huán)境對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)分為3組：正常對(duì)照組、低糖組(5 mmol/L)、高糖組(50 mmol/L)，各組加入葡萄糖后再放入培養(yǎng)箱作用48 h。

1.4DNA梯狀條帶凝膠電泳檢測(cè)離心(800 r/min，5 min)收獲各組細(xì)胞，0.01 mol/L PBS洗3次，將細(xì)胞沉淀重懸于400 μL細(xì)胞裂解液中，離心去上清液，加入RNase、蛋白酶K，酚/氯仿抽提DNA，20 μL TE溶解，1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線(xiàn)下照相，伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡離心(800 r/min，5 min)獲取各組細(xì)胞，0.01 mol/L PBS洗3次，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 mL流式管中，分別加入5 μL Annexin V/FITC(20 μg/mL)、10 μL PI(10 μg/mL)液，避光作用15 min，再加入400 μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用隨機(jī)軟件分析。

2　結(jié)　果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)C57小鼠海馬源性神經(jīng)干細(xì)胞(見(jiàn)圖1A)個(gè)體小而且呈透明圓形，懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)1周，可見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞球形成，隨球體增大，位于球體中心的干細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)z取不足出現(xiàn)一定程度壞死，呈現(xiàn)黑色斑塊(見(jiàn)圖1B)。經(jīng)傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞可增殖再次聚集形成細(xì)胞球，球體形態(tài)規(guī)則，折光性好。Nestin免疫熒光染色神經(jīng)干細(xì)胞球呈陽(yáng)性反應(yīng)(見(jiàn)圖1C)。對(duì)加入神經(jīng)干細(xì)胞分化液后呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示海馬源性神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元(見(jiàn)圖1D)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(見(jiàn)圖1E)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(見(jiàn)圖1F)。

圖1　神經(jīng)干細(xì)胞及鑒定

2.2DNA梯狀條帶凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)高糖(50 mmol/L)處理的神經(jīng)干細(xì)胞，其細(xì)胞提取的DNA中呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡梯狀條帶，而正常對(duì)照組和低糖組(5 mmol/L)提取的DNA中未出現(xiàn)梯狀條帶(見(jiàn)圖2)，實(shí)驗(yàn)證明高糖環(huán)境可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，正常對(duì)照組和低糖組(5 mmol/L)中有少量神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡(見(jiàn)圖3A、圖3B)，正常對(duì)照組為(5.83±0.36)%，低糖組為(6.25±0.52)%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組(50 mmol/L)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率明顯增加(見(jiàn)圖3C)，達(dá)到(20.97±1.21)%，分別與正常組和低糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：M為 DNA Maker；H為高糖組(50 mmol/L)；L為低糖組(5 mmol/L)； C為正常對(duì)照組。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡流式圖

3　討　論

神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，可對(duì)機(jī)體神經(jīng)損傷部位進(jìn)行再生修復(fù)，同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞具有遷移作用和極好的組織相容性[5]。經(jīng)靜脈輸入的外源性神經(jīng)干細(xì)胞可優(yōu)先遷移至機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位，發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)組織的作用，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞，其免疫原性低，移植后很少發(fā)生排異反應(yīng)，有利于移植細(xì)胞的存活[6]。以上特點(diǎn)促使神經(jīng)干細(xì)胞成為生物治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在移植治療腦出血、腦缺血、中樞神經(jīng)創(chuàng)傷及退變性腦病等研究中，對(duì)疾病動(dòng)物模型的治療取得良好效果。糖尿病是導(dǎo)致老年認(rèn)知障礙和癡呆的高危因素，可以引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡。在高糖環(huán)境下使用神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)老年認(rèn)知障礙等疾病進(jìn)行治療，可能會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡從而影響其修復(fù)能力。

凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，引發(fā)的自主有序的死亡現(xiàn)象。引發(fā)細(xì)胞凋亡的原因有生理性或病理性多種因素。在早期可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外膜是否含有磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)來(lái)確定凋亡的發(fā)生。正常細(xì)胞的PS存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，PS可從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外表面，暴露于細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，可與PS特異性結(jié)合。將Annexin V進(jìn)行熒光標(biāo)記作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞凋亡晚期，DNA在核小體連接處被核酸酶切斷，可產(chǎn)生200 bp的整數(shù)倍大小的DNA碎片，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞特征性的梯狀條帶[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬糖尿病時(shí)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞提取的DNA中出現(xiàn)碎片呈現(xiàn)特征性的梯狀條帶，同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率明顯增多，證實(shí)高糖可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示在對(duì)糖尿病病人進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療時(shí)，首先需要控制病人的血糖水平，然后再進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植，這樣才能保證神經(jīng)干細(xì)胞移植的成功率，確保最終治療效果。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立高糖環(huán)境對(duì)鼠海馬源性神經(jīng)干細(xì)胞刺激的模型，模仿并證實(shí)糖尿病病人大腦海馬區(qū)損傷后，機(jī)體調(diào)動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞或移植外源性神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡，不利于對(duì)損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)。但高糖是通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡，還需進(jìn)一步研究探討。

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(本文編輯郭懷印)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No.81300487)；山西醫(yī)科大學(xué)校青年基金項(xiàng)目資助(No.02201401)

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R587.1R255.4

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．014

1672-1349(2016)14-1610-04

2016-03-01)