呂殿紅，溫肖會(huì)，翟少倫，黃 忠，楊燕秋，周秀蓉，魏文康

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

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蛋雞群沙門(mén)氏菌的監(jiān)測(cè)

呂殿紅，溫肖會(huì)，翟少倫，黃 忠，楊燕秋，周秀蓉，魏文康*

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

[目的]了解蛋雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌的感染情況。[方法]采用沙門(mén)氏菌抗原和抗體檢測(cè)方法對(duì)2012～2015年采集的廣東省蛋雞場(chǎng)樣品進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA方法對(duì)1784血清樣品進(jìn)行了腸炎沙門(mén)氏菌和1 387份血清樣品進(jìn)行了鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體檢測(cè)；采用凝集試驗(yàn)方法對(duì)1 391份血清樣品進(jìn)行了雞白痢沙門(mén)氏菌抗體檢測(cè)；采用細(xì)菌培養(yǎng)、PCR方法對(duì)采自廣東省的活雞/死雞、環(huán)境拭子等1 458份樣品進(jìn)行了沙門(mén)氏菌檢測(cè)。[結(jié)果]腸炎、鼠傷寒、雞白痢3種血清型沙門(mén)氏菌抗體的陽(yáng)性率分別為16.70%、10.09%和1.01%；沙門(mén)氏菌抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率為1.65%。[結(jié)論]蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等3種沙門(mén)氏菌不同程度的感染，但是蛋雞群的總體感染率不高。

沙門(mén)氏菌；感染；抗體；陽(yáng)性率

沙門(mén)氏菌是常見(jiàn)的腸道病原菌之一，在自然界分布廣泛、種類繁多，目前已檢測(cè)出沙門(mén)氏菌血清型2 500余種，據(jù)報(bào)道在我國(guó)存在的血清型有292種[1]。沙門(mén)氏菌所導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱沙門(mén)氏菌感染。沙門(mén)氏菌不僅能引起動(dòng)物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，而且還能通過(guò)污染食物導(dǎo)致人的食物中毒，引發(fā)敗血癥等，對(duì)人類健康造成很大的威脅。在世界各國(guó)的各類細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門(mén)氏菌引起的食物中毒常居榜首。2000年，在科技部和衛(wèi)生部的支持下，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所建立的全國(guó)食品污染物監(jiān)測(cè)體系對(duì)食品中的污染物進(jìn)行了連續(xù)主動(dòng)監(jiān)測(cè)，食源性致病菌的監(jiān)測(cè)指標(biāo)選取沙門(mén)氏菌，這是因?yàn)樵谖覈?guó)內(nèi)陸地區(qū)細(xì)菌性食物中毒的暴發(fā)例數(shù)和發(fā)病人數(shù)多年來(lái)排第1位就是沙門(mén)氏菌感染。沙門(mén)氏菌是公共衛(wèi)生意義上具有重要意義的人獸共患病原菌之一，最為常見(jiàn)的人獸共患的沙門(mén)氏菌有鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、都柏林沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌等。我國(guó)城鄉(xiāng)居民對(duì)雞蛋的消耗量占禽蛋消費(fèi)量的85%以上，近十多年來(lái)年消耗量都超過(guò)2 000萬(wàn)t[2]，如果蛋雞場(chǎng)存在沙門(mén)氏菌的污染，將直接影響到雞蛋的質(zhì)量，對(duì)人民健康存在巨大的威脅，因此加強(qiáng)蛋雞場(chǎng)的沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)十分重要。筆者于2012年7月至2015年12月對(duì)廣東省部分地區(qū)蛋雞群進(jìn)行沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)，以期為沙門(mén)氏菌的凈化和預(yù)防提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集 來(lái)自廣東省的不同雞場(chǎng)115批次樣品，采集時(shí)間為2012年7月至2015年12月底。用于檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌抗體的雞血清樣品1 784個(gè)，用于檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體的樣品1 387份，用于檢測(cè)雞白痢沙門(mén)氏菌抗體1 391份；供檢測(cè)沙門(mén)氏菌的樣品1 458份，包括1日齡～56周齡的活雞1 222只、死亡雞48只、雞場(chǎng)環(huán)境拭子16份、環(huán)境和雞糞混合樣品128份、墊紙44份。以上商品代雞場(chǎng)均為存欄量超過(guò)10萬(wàn)只以上的雞場(chǎng)。樣品來(lái)源和數(shù)量等具體見(jiàn)表1。

1.2樣品處理對(duì)用于抗原檢測(cè)的活雞、死亡雞樣品無(wú)菌取內(nèi)臟及腸內(nèi)容物剪碎，加入滅菌的PBS充分研磨；將環(huán)境拭子直接置于滅菌的PBS中混勻；環(huán)境和雞糞混合樣品以及墊紙搗碎后與無(wú)菌PBS充分混合，過(guò)濾后取上清待用。

對(duì)上述PBS混合液進(jìn)行增菌處理：取1 mL接種于10 mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)內(nèi)，于(42±1)℃培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)，另取1 mL接種于10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內(nèi)，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3試劑/試劑盒、引物和沙門(mén)氏菌陽(yáng)性菌 腸炎沙門(mén)氏菌抗體(SE-Ab)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體(ST-Ab)試劑盒均為荷蘭Biochek公司產(chǎn)品(由北京天之泰生物科技有限公司提供)；雞白痢凝集抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清，均購(gòu)自北京中?？萍加邢薰荆簧抽T(mén)氏菌培養(yǎng)基TTB和SC、顯色培養(yǎng)基均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。針對(duì)沙門(mén)氏菌侵襲蛋白 A(invasionprotein A，invA)基因，參考文獻(xiàn)[3]方法設(shè)計(jì)PCR引物，由上海英濰捷基生物有限公司合成。沙門(mén)氏菌陽(yáng)性菌株，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4抗體水平檢測(cè)

1.4.1腸炎沙門(mén)氏菌抗體和鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體的ELISA檢測(cè)。 血清樣品按1∶100的比例進(jìn)行稀釋，將100 μL稀釋后的樣品添加到相應(yīng)的酶標(biāo)板孔內(nèi)，室溫孵育30 min，倒出孔內(nèi)容物，洗滌4次，最后1次倒轉(zhuǎn)反應(yīng)板，在吸水紙上輕輕拍打。然后，每孔添加100 μL酶標(biāo)二抗，室溫孵育30 min，洗滌4次；每孔加入100 μL底物，室溫下孵育15 min；加入100 μL終止液，終止反應(yīng)，調(diào)零，使用酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值。檢測(cè)時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，當(dāng)陰性對(duì)照的平均吸光度小于0.3，陽(yáng)性對(duì)照的平均吸光度大于等于0.3，二者之間的差值大于0.15，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果可靠。S/P值=(待檢樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)/(陽(yáng)性樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)。若S/P值≤0.499，說(shuō)明樣品抗體為陰性；若S/P值≥0.500，說(shuō)明樣品抗體值為陽(yáng)性。

1.4.2雞白痢抗體檢測(cè)。采用平板凝集方法，用吸管吸取抗原50 μL，垂直滴加在潔凈玻璃板上，然后吸取50 μL雞血清,與抗原充分混合均勻，并使其散開(kāi)至直徑為2 cm。不斷搖動(dòng)玻璃板，計(jì)時(shí)判定結(jié)果，同時(shí)設(shè)置強(qiáng)陽(yáng)性血清、弱陽(yáng)性血清、陰性血清對(duì)照。

1.5抗原檢測(cè)取增菌液在沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基上劃線，結(jié)合培養(yǎng)特性，取可疑菌落接種至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，提取DNA。以提取的DNA為模板，采用PCR方法[3]進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，擴(kuò)增的目的片段為403 bp。

2　結(jié)果與分析

對(duì)采集的血清樣品進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌抗體、鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體、雞白痢抗體檢測(cè)，不同時(shí)期幾種抗體的陽(yáng)性率不同(表1)。沙門(mén)氏菌在沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基上呈現(xiàn)特征的紫紅色圓形菌落(圖1)，挑取疑似菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，均出現(xiàn)目的條帶。沙門(mén)氏菌PCR鑒定的結(jié)果見(jiàn)圖2，沙門(mén)氏菌的分離情況及分離率見(jiàn)表1。

表1　不同來(lái)源樣品幾種沙門(mén)氏菌抗體和沙門(mén)氏菌的檢測(cè)結(jié)果

圖1　沙門(mén)氏菌在沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基上的觀察結(jié)果Fig.1　Observation results of salmonella in differential mediums

注：M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～8.沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基上疑似陽(yáng)性樣品；9.陽(yáng)性對(duì)照；10.陰性對(duì)照。Note：M.DNA marker DL2000; 1-8.Suspected samples in differential mediums; 9.Positive control; 10.Negative control.圖2　部分沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.2　Results of PCR verification of salmonella positive samples

3　討論與結(jié)論

沙門(mén)氏菌是1885年由沙門(mén)氏等在霍亂流行時(shí)分離到豬霍亂沙門(mén)氏菌，因此定名為沙門(mén)氏菌屬。沙門(mén)氏菌的存在嚴(yán)重威脅著人民的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展其在養(yǎng)殖場(chǎng)的存在也時(shí)有報(bào)道[4-9]，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害很大，另外由于獸藥的濫用，導(dǎo)致沙門(mén)氏菌耐藥性的增強(qiáng)[10-11]，給該病的防治帶來(lái)很大困難。實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)對(duì)于有效防止沙門(mén)氏菌感染的擴(kuò)散、為畜禽產(chǎn)品的安全提供有效保障。

該研究結(jié)果表明，廣東省部分地區(qū)蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等幾種沙門(mén)氏菌的感染，但是雞群總體感染率不高。這可能與監(jiān)測(cè)樣品多數(shù)來(lái)自大型雞場(chǎng)有關(guān)，大型雞場(chǎng)管理相對(duì)完善、飼養(yǎng)條件相對(duì)較好使沙門(mén)氏菌的流行傳播受阻。相對(duì)而言，小型雞場(chǎng)及散養(yǎng)雞環(huán)境較差條件較簡(jiǎn)陋，容易流行和爆發(fā)沙門(mén)氏菌[12]，因此對(duì)小型雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌的監(jiān)測(cè)和防控將是今后工作的重點(diǎn)，建議相關(guān)部門(mén)和機(jī)構(gòu)加以重視。

2012年監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，父母代的雞場(chǎng)環(huán)境中檢測(cè)到沙門(mén)氏菌，因此在2013年加大對(duì)雞場(chǎng)血清中3種沙門(mén)氏菌抗體的監(jiān)測(cè)力度，并且對(duì)雞群加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、對(duì)雞場(chǎng)生物安全等方面加大防控力度，2015年已經(jīng)獲得改善。這充分說(shuō)明了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和防控措施等對(duì)控制動(dòng)物疫病的重要性。

該研究中檢出的沙門(mén)氏菌的24個(gè)陽(yáng)性樣品，包括18個(gè)環(huán)境拭子和6個(gè)來(lái)自雛雞的肝臟和卵黃中的樣品。這與文獻(xiàn)[13-14]的報(bào)道相一致。筆者未對(duì)雞二蛋和蛋殼上的沙門(mén)氏菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但是蛋雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌的存在必然導(dǎo)致雞蛋的污染機(jī)會(huì)增多，據(jù)報(bào)道雞蛋和雞蛋殼沙門(mén)氏菌的污染率不低[15]，人們?cè)谑秤秒u蛋時(shí)接觸蛋殼，很容易造成間接感染，因此建議雞蛋食用前進(jìn)行清潔處理。雖然我國(guó)人民習(xí)慣吃熟食，但是隨著中西文化的交流，一些外來(lái)飲食習(xí)慣(如生食等)逐漸被國(guó)人接受，因此加強(qiáng)沙門(mén)氏菌的控制十分重要，應(yīng)切斷其傳播途徑，保障人類和動(dòng)物健康。

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Monitoring of Salmonella in Laying Hens

LU Dian-hong, WEN Xiao-hui, ZHAI Shao-lun, WEI Wen-kang*et al

(Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention, Guangzhou, Guangdong 510640)

[Objective] To study infection of laying hens with salmonella. [Method] The antigen and antibody of salmonella in laying hens collected from Guangdong Province during 2012-2015 were detected. ELISA method and aggregation test were used to detect the antibody titer of serum samples aboutSalmonellaenteritidis,SalmonellatyphimuriumandSalmonellapullorum, and then germiculture and PCR were used to check out salmonella from chickens and environment swabs. [Result] Positive rates of three kinds of antibody were 16.70%, 10.09% and 1.01% respectively, while the positive rate of salmonella antigen was 1.65%. [Conclusion] The laying hens are infected with the three kinds of salmonella, but their infection rates were not high on the whole.

Salmonella; Infection; Antibody; Positive rate

廣東省促進(jìn)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012B040302010)；廣東省技術(shù)交易體系與科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)建設(shè)領(lǐng)域項(xiàng)目(2014B040404061，2016A040401012)；廣東省科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才服務(wù)領(lǐng)域項(xiàng)目(2014A070713020)。

呂殿紅(1969- )，女，安徽來(lái)安人，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

2016-05-30

S 85

A

0517-6611(2016)19-163-03