鄭浩然， 楊海龍

(1.溫州醫(yī)科大學仁濟學院，浙江溫州 325035；2.溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

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鐵皮石斛對靈芝多糖深層發(fā)酵的影響

鄭浩然1， 楊海龍2*

(1.溫州醫(yī)科大學仁濟學院，浙江溫州 325035；2.溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

[目的]研究鐵皮石斛對靈芝生長及胞外多糖分泌的影響，并分析靈芝多糖組分的變化。[方法]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的鐵皮石斛，分析靈芝生物量和胞外多糖含量的變化，并采用KTA explorer柱層析分析多糖組分。[結(jié)果]鐵皮石斛可促進靈芝胞外多糖的合成，添加量以10 g/L效果最佳；添加鐵皮石斛發(fā)酵未改變靈芝多糖的組分。[結(jié)論]在靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量鐵皮石斛有助于靈芝多糖的高效生產(chǎn)。

鐵皮石斛;靈芝;多糖;深層發(fā)酵

靈芝(Ganodermalucidum) 是我國傳統(tǒng)名貴中藥，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗衰老、提高機體免疫功能、抑制腫瘤、抗病毒和保肝護肝等作用[1-4]。近年來，靈芝液體培養(yǎng)以其生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)物營養(yǎng)豐富以及便于收集加工等優(yōu)點而越來越受到重視[5-6]。中藥中含有纖維、糖類、生物堿等多種成分，有些成分可促進靈芝生長及活性物質(zhì)的生產(chǎn)。筆者篩選出合適的中藥加入靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，研究鐵皮石斛對靈芝生長及其主要活性次生代謝產(chǎn)物(多糖和靈芝酸)生產(chǎn)的影響。

1　材料與方法

1.1材料靈芝由溫州大學生命與環(huán)境科學學院發(fā)酵工程研究室篩選保存。鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)由植物組織培養(yǎng)法獲得，60 ℃烘干，粉碎，過60目篩。

1.2發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 35 g/L，蛋白胨 3.5 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO41.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，VB110 mg/L。

1.3接種和培養(yǎng)將培養(yǎng)基121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入靈芝液體種，接種量10%。搖瓶條件：250 mL三角瓶，裝液量80 mL，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間5 d。

1.4測定項目與方法①生物量：采用重量法測定；②胞外多糖：采用硫酸-苯酚法測定；③還原糖：采用DNS法測定。

1.5多糖的分離提取及組分分析發(fā)酵液離心取上清液，減壓濃縮至適當體積，加4倍體積95%乙醇沉淀，4 ℃冰箱中靜置24 h。離心，沉淀用蒸餾水溶解，Sevag法脫蛋白，以KTA explorer 快速純化系統(tǒng)進行多糖組分分析。色譜柱HiPrepTM16/10 DEAE，上樣量2 mL，以H2O，0.05、0.20和0.50 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，流速2 mL/ min, 分步收集，每管5 mL，采用苯酚-硫酸法進行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1鐵皮石斛添加量對靈芝生長和胞外多糖分泌的影響在靈芝清液培養(yǎng)基中添加0、5、10、15、20 g/L鐵皮石斛，考察其對靈芝生長及胞外多糖分泌的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，鐵皮石斛對靈芝生長有一定的抑制作用，加入量大(20 g/L)時較明顯，但添加量在10 g/L范圍內(nèi)抑制作用不明顯。在對胞外多糖分泌方面，加入10 g/L左右的鐵皮石斛對靈芝胞外多糖的生產(chǎn)有促進作用。

圖1　鐵皮石斛添加量對靈芝生長和胞外多糖分泌的影響Fig.1　Effects of D.candidum quantity on the growth and polysaccharide produciton of G.lucidum

2.2鐵皮石斛對靈芝發(fā)酵過程的影響在靈芝清液發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 g/L鐵皮石斛，考察鐵皮石斛對靈芝發(fā)酵過程的影響。加鐵皮石斛與不加鐵皮石斛(對照)情況下靈芝生長及胞外多糖分泌過程見圖2。由圖2可知，靈芝對鐵皮石斛的存在有一個適應過程，前40 h生長緩慢，但在此過程中胞外多糖的分泌較對照迅速，其后靈芝的生長加速，在120 h時與對照接近。為此，將添加鐵皮石斛的靈芝發(fā)酵延長其發(fā)酵時間24 h，其生物量可達對照水平。

圖2　鐵皮石斛對靈芝發(fā)酵過程的影響Fig.2　Effects of D.candidum on the fermentation process of G.lucidum

2.3含鐵皮石斛基質(zhì)發(fā)酵靈芝的多糖組分分析在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 g/L鐵皮石斛可以促進靈芝胞外多糖的生產(chǎn)，為考察鐵皮石斛對靈芝胞外多糖組成的影響，對清液發(fā)酵靈芝液中的多糖(GLP)、含鐵皮石斛基質(zhì)發(fā)酵的靈芝液中的多糖(GDP)分別進行分離提取，并以Sevag法去除大部分蛋白，再以KTA explorer(離子交換柱)進行多糖組分分析。

表1DEAE分離洗脫各峰的胞外多糖含量

Table 1Exopolysaccharide content in each peak from the DEAE column

峰SampleGLP含量Contentmg占比Percentage%GDP含量Contentmg占比Percentage%PS13.7568.684.0565.85PS20.173.110.396.34PS30.8615.751.2019.51PS40.6812.450.518.29

3　結(jié)論

(1)鐵皮石斛對靈芝的生長有一定的抑制作用，在添加量較小(10 g/L)時抑制作用不明顯，但能刺激靈芝胞外多糖的合成。

圖3　GLP在DEAE柱上經(jīng)H2O，0.05、0.20、0.50 mol/L NaCl的洗脫曲線Fig.3　The chromatography profile of GLP on DEAE column eluted by H2O, 0.05, 0.20, and 0.50 mol/L NaCl

圖4　GDP在DEAE柱上經(jīng)H2O，0.05、0.20、0.50 mol/L NaCl的洗脫曲線Fig.4　The chromatography profile of GDP on DEAE column eluted by H2O, 0.05, 0.20, and 0.50 mol/L NaCl

[1] 張群豪，林志彬.靈芝多糖(GL- B)對腫瘤壞死因子α和γ干擾素產(chǎn)生及其mRNA表達的影響[J].北京醫(yī)科大學學報，1999，31(2)：179-183.

[2] 趙東旭，楊新林，王幫武,等.靈芝研究的若干進展[J].食用菌學報，1999，6(3)：59-64.

[3] EL-MEKKAWY S，MESELHY M R，NAKAMURA N，et al.Anti-HIV-1 protease substances fromGanodermalucidum[J].Phytochem，1998，49(6)：1651-1657.

[4] MIN B S，GAO J J，NAKAMURA N，et al.Triterpenes from the spores ofGanodermalucidumand their cytotoxicity against Meth-A and LLC tumor cells[J].Chem Pharm Bull，2000，48(7)：1026-1033.

[5] 李平作.靈芝深層發(fā)酵生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究[D].無錫：無錫輕工大學，1997.

[6] 楊海龍，章克昌.以薏苡仁為基質(zhì)的靈芝液體發(fā)酵：Ⅱ.主要活性成分分析[J].中國食品學報，2006,6(5)：105-110.

Effects ofDendrobiumcandidumon the Polysaccharide Fermentation ofGanodermalucidumby Submerged Culture

ZHENG Hao-ran1, YANG Hai-long2*

(1.Renji College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035; 2.School of Life and Environment Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325035)

[Objective] To explore the effects ofDendrobiumcandidumon the growth ofGanodermalucidumandand its exo-polysaccharide production and analyze the changes of polysaccharide components.[Method]D.candidumwas added to the media, and the biomass and polysaccharide content ofG.lucidumwere analyzed.The polysaccharide components were analyzed by the column chromatography analysis of KTA explorer.[Result] The production of exopolysaccharide was enhanced byD.candidum, and 1% of addition amount was suitable.The components of exopolysaccharide were not changed byD.candidum.[Conclusion] It is helpful to enhance the polysaccharide production ofG.lucidumby the addition ofD.candidumin the submerged culture media.

Dendrobiumcandidum;Ganodermalucidum; Polysaccharide; Submerged culture

浙江省自然科學基金項目(Y3100711)。

鄭浩然(1990- )，男，江西資溪人，本科生，專業(yè)：信息系統(tǒng)與信息管理。*通訊作者，教授，博士，從事發(fā)酵工程研究。

2016-05-16

S 567.3+1;TQ925

A

0517-6611(2016)19-141-02