丁云，陸肖瑋

（江蘇省無錫市婦幼保健院 乳腺科，江蘇 無錫 214002）

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MicroRNA-134通過下調(diào)叉頭框蛋白M1/人基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲

丁云，陸肖瑋

（江蘇省無錫市婦幼保健院 乳腺科，江蘇 無錫 214002）

目的探討microRNA-134（miR-134）在乳腺癌中的表達(dá)及其影響乳腺癌遷移、侵襲能力的分子機(jī)制。方法選取2013年1月-2015年2月于本院乳腺病科行手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織30例、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織35例及正常乳腺組織15例。通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法分別檢測miR-134在腫瘤和正常乳腺組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析miR-134表達(dá)與患者臨床特征間的相關(guān)性；通過miR-134模擬物轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，采用細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)評價(jià)過表達(dá)miR-134對細(xì)胞遷移能力的影響，采用Transwell侵襲小室試驗(yàn)評價(jià)過表達(dá)miR-134后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化。通過免疫組織化學(xué)染色檢測miR-134與下游潛在靶點(diǎn)叉頭框蛋白M1蛋白表達(dá)關(guān)系，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染miR-134模擬物后其下游潛在靶點(diǎn)叉頭框蛋白M1及下游效應(yīng)分子人基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)變化。結(jié)果miR-134在正常乳腺組織、乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)量依次降低（P＜0.05）。乳腺癌組織中低水平的miR-134與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.05）；在體外試驗(yàn)中，過表達(dá)miR-134能夠顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞的遷移及侵襲能力（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實(shí)miR-134與叉頭框蛋白M1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及蛋白免疫印記結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-134后可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞中叉頭框蛋白M1及人基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論miR-134在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-134可能通過下調(diào)叉頭框蛋白M1/人基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

MicroRNA-134；乳腺癌；叉頭框蛋白M1；人基質(zhì)金屬蛋白酶2；遷移；侵襲

在我國，乳腺癌是嚴(yán)重危害女性身體健康的公共衛(wèi)生問題［1］。乳腺癌病理分型復(fù)雜，部分侵襲性較高的病理類型患者治療難度大，易發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差［2］。因此，尋找能夠抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的分子治療靶點(diǎn)對提高乳腺癌治療效果，延長乳腺癌患者生存時(shí)間具有重要意義。

微小RNA（microRNA，以下簡稱：miR）是一類長約19～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈短RNA［3］。腫瘤生物學(xué)研究成果表明，miR-134能通過抑制包括PAK2［4］、KRAS［5］及WWOX［6］在內(nèi)多的多個(gè)癌基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)。目前，miR-134在乳腺癌中的臨床意義及生物學(xué)功能尚不清楚。

本研究通過檢測miR-134在不同病理類型的乳腺癌組織中的表達(dá)及對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲能力的調(diào)控作用，研究miR-134在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的臨床意義及作用機(jī)制，為乳腺癌特別是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的分子診斷與靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床標(biāo)本及主要試劑

選取2013年1月-2015年2月于江蘇省無錫市婦幼保健院乳腺科行手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）組織30例、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（invasive breast ductal carcinoma，IBDC）組織35例及正常乳腺組織15例。所有入組患者平均年齡（49.7±3.1）歲。標(biāo)本切除后行多點(diǎn)取材，分別保存于4%多聚甲醛溶液及液氮當(dāng)中。Trizol試劑及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，miR-134qRT-PCR引物試劑盒、miR-134模擬物及陰性對照模擬物均購自廣州銳博生物科技有限公司；叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）引物（正向引物5'-GGGCGCAC GGCGGAAGATGAA-3'；反向引物5'-CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC-3'），人基質(zhì)金屬蛋白酶2（human matrix metalloproteinase 2，MMP-2）引物（正向引物5'-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3'；反向引物 5'-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3'）及β-actin引物（正向引物 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'）由上海升工生物科技有限公司合成。基質(zhì)膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國康寧公司。兔抗人FOXM1多克隆抗體（ab83097）、兔抗人MMP-2多克隆抗體（ab37150）及鼠抗人β-actin單克隆抗體（ab6276）購自美國Abcam公司。乳腺癌MDA-MB-231由本實(shí)驗(yàn)室自存。RIPA裂解液、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒均購自美國密理博公司。

1.2RNA提取及qRT-PCR

采用Trizol試劑通過苯酚-氯仿抽提法提取組織及MDA-MB-231細(xì)胞中總RNA。按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，每反應(yīng)管內(nèi)加入500 ng RNA，通過miR-134特異性RT-PCR引物反轉(zhuǎn)錄miR-134，采用Oligo-dT引物法逆轉(zhuǎn)錄FOXM1、MMP-2及β-actin mRNA。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后以2μl cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，按2-ΔΔCT法計(jì)算miR-134及FOXM1、MMP-2及β-actin相對表達(dá)量。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）的 1×改良 Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基中，穩(wěn)定傳代2～3代后通過胰酶消化細(xì)胞并接種于六孔板中，接種密度以貼壁后融合度在50%左右為準(zhǔn)。按LipofectamineTM2000及銳博模擬物轉(zhuǎn)染說明書，按終濃度100 nmol/孔，分別向MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134模擬物及空白對照組模擬物。轉(zhuǎn)染4 h后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基。

1.4細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染24 h后的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中過夜培養(yǎng)至融合度90%以上。吸除原有培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶液洗滌細(xì)胞兩遍，使用100μl槍頭制作細(xì)胞劃痕后使用PBS溶液洗去殘余細(xì)胞，使用含5%血清的1×DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.5Transwell侵襲小室

用1×DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，按100μl每孔包被Transwell小室底膜上室面。收集轉(zhuǎn)染48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，按250μl每孔接種于 Transwell小室上室中，24孔板內(nèi)每孔加入750μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍后采用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)下室面細(xì)胞數(shù)量。

1.6免疫組織化學(xué)染色

將組織標(biāo)本經(jīng)脫水、石蠟包埋處理，自動(dòng)切片機(jī)制作4μm組織切片，再經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟、水化，于pH 6.0枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)；3%過氧化氫H2O2水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；10%山羊血清封閉滴加兔抗人FOXM1抗體（1∶100），4℃孵育過夜；洗去多余一抗后，加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min；洗去殘余未結(jié)合二抗，滴加辣根過氧化物酶-鏈酶卵白素復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取10個(gè)視野，按以下標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)閱片、評分：染色強(qiáng)度評分：0分：陰性；1分：弱陽性；2分：中度陽性；3分：強(qiáng)陽性。陽性腫瘤細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；75%為4分。每視野評分=染色強(qiáng)度評分×陽性腫瘤細(xì)胞百分比評分，切片的最終評分為10個(gè)視野的平均得分。

1.7蛋白免疫印跡法（Western blot）

收集轉(zhuǎn)染72 h的MDA-MB-231細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測定總蛋白濃度。每樣本取50μg總蛋白進(jìn)行垂直電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后以1∶1 000稀釋的FOXM1、MMP-2及β-actin一抗結(jié)合相應(yīng)目的蛋白，以1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔或羊抗鼠二抗結(jié)合一抗，ECL法發(fā)光檢測蛋白相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1乳腺癌組織中miR-134的表達(dá)變化

通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織比較，DCIS組織中miR-134的相對表達(dá)量為（0.475± 0.031），而IBDC組織中表達(dá)則更低僅為（0.281± 0.147）。對兩組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)，miR-134在正常乳腺組織、DCIS組織及IBDC組織中的表達(dá)水平依次降低（F=3.841，P=0.037）。提示miR-134的表達(dá)量與乳腺癌侵襲能力相關(guān)。見圖1。

2.2乳腺癌組織中miR-134表達(dá)與患者臨床病理特點(diǎn)間的相關(guān)性

筆者將65例患者的臨床數(shù)據(jù)和病理診斷資料進(jìn)行二分類后，分別計(jì)算miR-134在不同特征分類下的相對表達(dá)量。存在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期）的患者乳腺癌組織中miR-134的表達(dá)量更低。提示miR-134在調(diào)控乳腺癌侵襲過程中可能具有一定作用。見附表。

圖1　miR-134在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)

附表　miR-134表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n=65±s）

附表　miR-134表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n=65±s）

注：1）與存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，P＜0.05；2）與III+IV期比較，P＜0.01

2.3miR-134對MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

通過在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134模擬物過表達(dá)miR-134后，采用劃痕愈合試驗(yàn)證明過表達(dá)miR-134能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移（42.93±4.81）vs（70.96±4.33）（t=9.203，P=0.007）。進(jìn)一步的Transwell侵襲小室檢測結(jié)果表明過表達(dá)miR-134也能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力（19.16±1.78）vs（33.41±2.15）（t=8.727，P=0.009）。見圖2。

2.4miR-134靶向下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中FOXM1表達(dá)

FOXM1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)錄激活因子。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1是miR-134的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步的體外研究結(jié)果表明在MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-134能夠顯著下調(diào) FOXM1 mRNA（1.000±0.000）vs（0.371± 0.018）（t=34.487，P＜0.001）的表達(dá)。除此之外，筆者在乳腺癌組織標(biāo)本中也證實(shí)miR-134和FOXM1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān) ［DCIS組：（8.785±1.032）vs（4.371±1.214）（t=2.401，P=0.031）；IBDC組：（12.026±3.741）vs（6.128±1.306）（t=2.583，P= 0.028）］，提示miR-134對FOXM1的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員之一，對多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，既往研究表明，F(xiàn)OXM1能夠促進(jìn)MMP2的轉(zhuǎn)錄以提高細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)水平，筆者的研究證實(shí)過表達(dá)miR-134可以下調(diào)MMP-2的表達(dá)（1.000± 0.000）vs（0.412±0.033）（t=30.024，P＜0.001）。見圖3、4。

圖2　過表達(dá)miR-134對MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

圖3　miR-134與FOXM1表達(dá)相關(guān)性

圖4　過表達(dá)miR-134對MDA-MB-231細(xì)胞FOXM1及MMP-2表達(dá)的影響

3　討論

乳腺癌是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。乳腺癌病理類型復(fù)雜，腫瘤異質(zhì)性高［7］，乳腺癌的淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移是限制患者治療效果及預(yù)后的主要因素之一。近年來，microRNA在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。例如，miR-99家族能通過抑制TGF-β/SMAD3通路的活化來抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力［8］。

miR-134是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有多種生物學(xué)功能的microRNA。神經(jīng)生物學(xué)研究表明，在腦神經(jīng)組織缺血再灌注過程中，高水平的miR-134能夠通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［9］。而在包括腎癌、骨肉瘤在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤中miR-134都呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢并與腫瘤惡性生物學(xué)行為相關(guān)，提示miR-134可能是一種具有抑癌作用的microRNA［10-11］。

在本研究中，筆者通過檢測證實(shí)，乳腺癌中miR-134表達(dá)水平顯著降低。更重要的是，與乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織比較，侵襲性較高的IBDC組中的miR-134表達(dá)量更低。同時(shí)，筆者通過分析不同臨床病理特征分類下miR-134的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，miR-134低表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期密切相關(guān)。上述結(jié)果提示，miR-134對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移可能具有一定的抑制作用。在體外，筆者通過基因轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-134后采用細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)和Transwell侵襲小室試驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-134能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在微觀上闡明了miR-134對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。

FOXM1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，由于其在多種人類惡性腫瘤中都高表達(dá)，因而其具有重要的腫瘤靶向治療價(jià)值［12］。包括miR-204［13］、miR-370［14］及miR-877［15］在內(nèi)多個(gè)microRNA都能通過下調(diào)FOXM1的表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展。本課題中，筆者通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1也是miR-134的下游靶點(diǎn)之一。在體外試驗(yàn)中，筆者在MDA-MB-231細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-134能夠顯著降低FOXM1的表達(dá)水平，提示FOXM1是miR-134在乳腺癌細(xì)胞中的有效靶點(diǎn)?；|(zhì)金屬蛋白酶是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的直接效應(yīng)分子，筆者通過文獻(xiàn)檢索［16］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1能夠結(jié)合在MMP-2的啟動(dòng)子區(qū)域并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄激活。筆者通過qRT-PCR及Western blot檢測證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-134在下調(diào)FOXM1的同時(shí)也能夠降低MMP-2的表達(dá)。因而，筆者初步推斷miR-134抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲時(shí)通過抑制FOXM1/MMP-2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-134在乳腺導(dǎo)管癌組織中表達(dá)顯著降低。miR-134可能通過下FOXM1/MMP-2的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

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（張蕾編輯）

MicroRNA-134inhibits cell migration and invasion by targeting forkhead box protein M1/human matrix metalloproteinase 2 in breast carcinoma

Yun Ding，Xiao-wei Lu
（Department of Breast Surgery，Wuxi Hospital for Maternal and Child Health Care，Wuxi，Jiangsu 214002，China）

Objective To investigate the expression ofmicroRNA-134（miR-134）in female breast carcinoma and its role for tumor cell migration and invasion.Methods Between January 2013 and February 2015，30 ductal carcinomain situ（DCIS）tissues，35 invasive breast ductal carcinoma（IBDC）tissues and 15 normal breast tissues were collected and investigated.The expressions ofmiR-134were detected by qRT-PCR.The relationship between miR-134and clinical features was analyzed by student-t test.miR-134mimics was transfected intoMDA-MB-231 cells.Wound healing assay and transwell assay were used to measure cell migration and invasion，respectively.The correlation betweenmiR-134and forkhead box protein M1，a potential target ofmiR-134，was analyzed by IHC staining.The expression changes of M1 and downstream effector molecules of humanMMP2in the potential target ofthe downstream potential target aftermicroRNA-134mimics infection were detected by qRT-PCR and western blotting.Results The expression ofMiR-134was significantly gradually decreased from normal breast tissue，in situ breast ductal carcinoma and invasive ductal carcinoma of the breast.The low expression ofMiR-134in breast cancer was significantly correlated with tumor lymph node metastasis and TNM stage（P＜0.05）.The migration and invasion of MDA-MB-231 cells capability were significantly reduced by over expression ofMiR-134in vitro.The expression ofmiR-134and the fork head boxM1was negative correlation confirmed by IHC（P＜0.05）.The results of qRT-PCR and western blotting showed over expression ofMiR-134could suppress breast cancer cells forkhead box proteinM1andMMP2expression level（P＜0.05）.ConclusionsMiR-134expression is down regulated in breast cancer tissues.miR-134may inhibit the migration and invasion of breast cancer cells by down regulating the expression ofM1/MMP2 2.

microRNA-134；breast cancer；fork head box protein M1；human matrix metalloproteinase 2；migration；invasion

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.009

1005-8982（2016）16-0043-06

2016-01-06

陸肖瑋，E-mail：13815100097@126.com