王德剛　許傳勇　姜玉祥　闞衛(wèi)兵△　肖志鋒姚　麗劉　婉謝殿洪湯　豪　張玉婷（.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 0006；.山東省威海市威海衛(wèi)人民醫(yī)院，山東 威海 6400）

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黃芪甲苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的人滑膜細(xì)胞和人軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的調(diào)控作用*

王德剛1許傳勇2姜玉祥1闞衛(wèi)兵1△肖志鋒1姚麗1劉婉1謝殿洪1湯豪1張玉婷1
（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062；2.山東省威海市威海衛(wèi)人民醫(yī)院，山東 威海 264200）

目的 觀察黃芪甲苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的人滑膜細(xì)胞和人軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）、Ⅱ型膠原羧基端肽（CTX-Ⅱ）、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）的調(diào)控作用，初步闡釋黃芪甲苷治療骨關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制。方法 通過(guò)β-catenin慢病毒載體轉(zhuǎn)染正常人滑膜細(xì)胞，激活其Wnt/βcatenin信號(hào)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的人滑膜細(xì)胞與正常人軟骨細(xì)胞置于Transwell小室中共培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的人滑膜細(xì)胞對(duì)人軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響。黃芪甲苷混懸液干預(yù)共培養(yǎng)體系，采用Western bolt方法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)滑膜細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)的影響；采用ELISA方法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表達(dá)的影響。結(jié)果 βcatenin慢病毒載體轉(zhuǎn)染正常人滑膜細(xì)胞后成功激活Wnt信號(hào)通路并與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸受到抑制，軟骨細(xì)胞胞體邊緣與板壁接觸處發(fā)白，折光度增加，細(xì)胞貼壁強(qiáng)度降低。黃芪甲苷干預(yù)后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào) （P＜0.01）；ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)滑膜與軟骨細(xì)胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表達(dá)與正常對(duì)照相比明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論 滑膜細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以使軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。黃芪甲苷可以降低滑膜細(xì)胞β-catenin表達(dá)，且與干預(yù)時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)。黃芪甲苷可以抑制滑膜細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路，下調(diào)MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表達(dá)。黃芪甲苷可能通過(guò)抑制OA滑膜Wnt/β-catenin信號(hào)通路，改善滑膜炎癥、調(diào)控滑膜-軟骨共同體系微環(huán)境、達(dá)到抑制軟骨降解，促進(jìn)軟骨細(xì)胞功能恢復(fù)而治療骨關(guān)節(jié)炎。

黃芪甲苷Wnt信號(hào)通路細(xì)胞共培養(yǎng)MMP-7CTX-ⅡCOMP

【Abstract】Objective：To observe the effect of AstragalosideⅣon MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP of co-culture system of chondrocytes and human synovial cells mediated by Wnt/β-catenin signal pathway，and to clarify the molecular mechanism of Astragaloside IV in the treatment of OA.Methods：β-catenin over expressing lentivirus vector was constructed to transfect synovial cells of normal people.Synovial cells and chondrocytes were cultured in transwell chamber to simulate the joint system environment between synovium and cartilage.The influence of Wnt/β-catenin signal pathway in human synovial cells on human chondrocytes morphological changes was observed with inverted microscope.Astragaloside IV intervened co-cuture system.Western bolt Method was used to test the influence of Astragaloside IV on β-catenin protein expression of synovial cells.ELISA Method was used to test the influence of Astragaloside IV on MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP in the culture supernatant.Results：After transfected by lentivirus vector，fluorescent microscopy showed that most of the synovial cells arose fluorescence. Western bolt test showed that the expression of β-catenin in the cytoplasm and nucleus of synovial cells increasedsignificantly after transfected（P＜0.01）.ELISA results showed that AstragalosideⅣsignificantly regulated the level of MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP down in co-culture cells supernatant（P＜0.01）.Conclusion：The growth of chondrocytes can be affected by synovial cells which is mediated by Wnt/β-catenin signal pathway.β-catenin over expressing lentivirus can activate Wnt/β-catenin signaling pathway.The level of MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP in co-cuture system increase significantly after Wnt/β-catenin signal pathway has been activatied.Astragaloside IV can inhibit Wnt/β-catenin signaling pathway，regulate the expression level of MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP down，relieve harm of abnormal synovial cells contributing to chondrocytes and the degradation of cartilage matrix，and promote the restoration of OA.

【Key words】AstragalosideⅣ；Wnt signal pathway；Co-culture，MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）為老年人常見(jiàn)、多發(fā)且比較難治的一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性降解，出現(xiàn)關(guān)節(jié)周邊骨贅形成、軟骨下骨板增厚、關(guān)節(jié)滑膜的病變。KOA不僅會(huì)引起膝關(guān)節(jié)疼痛，甚至可引起關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在OA動(dòng)物模型滑膜組織和滑膜細(xì)胞中是激活的，其下游基因基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP7）的表達(dá)是升高的，補(bǔ)腎活血方對(duì)其具有調(diào)控作用［1-4］，對(duì)補(bǔ)腎活血方中中藥單體篩選發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對(duì)滑膜細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有顯著調(diào)控作用。2015年1至6月，本研究觀察了黃芪甲苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的人滑膜細(xì)胞和人軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系相關(guān)因子的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與分組1）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：（1）正常人滑膜細(xì)胞（HS）及人軟骨細(xì)胞（HC-a）購(gòu)于北京裕恒豐科技有限公司，廠家：美國(guó)ScienCell公司。規(guī)格：＞5×105個(gè)細(xì)胞/mL，產(chǎn)品編號(hào)：（HS）-NO.4700，（HC-a）-NO.4650。（2）β-catenin慢病毒，β-catenin過(guò)表達(dá)慢病毒濃縮液由上海鴻立生物技術(shù)有限公司重組、測(cè)序、包裝、收獲、濃縮、純化后供給，病毒滴度為1×108TU/mL。2）細(xì)胞培養(yǎng)：（1）β-catenin慢病毒轉(zhuǎn)染人滑膜細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)滑膜細(xì)胞至細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%時(shí)，棄去舊的培養(yǎng)液，按預(yù)實(shí)驗(yàn)所得10 moi（multiplicity of infection）加入稀釋的病毒液，24 h后棄去病毒液，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率，Western blot檢測(cè)滑膜細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平，為下一步實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。（2）Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的人滑膜細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)。人滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞分別接種于多聚賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；人滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞Transwell小室共培養(yǎng)時(shí)，按常規(guī)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)方法將人滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室和下室，再于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。（3）黃芪甲苷混懸液干預(yù)共培養(yǎng)體系。黃芪甲苷混懸液制備：根據(jù)人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值計(jì)算稱(chēng)取藥粉，溶解于生理鹽水內(nèi)，制成藥液質(zhì)量濃度為0.009 g/mL的混懸液備用。往滑膜細(xì)胞所在的上室內(nèi)分別加入濃度5%、10%、15%的黃芪甲苷混懸液，分別為低、中、高劑量組［5］，孵育12 h（黃芪甲苷孵育12 h組）、24 h（黃芪甲苷孵育24 h組）、48 h（黃芪甲苷孵育48 h組）。黃芪甲苷處理滑膜細(xì)胞的同時(shí)，將軟骨細(xì)胞傳代至另外一個(gè)新的6孔板內(nèi)培養(yǎng)。待滑膜細(xì)胞用黃芪甲苷處理的時(shí)間點(diǎn)到了以后，將滑膜細(xì)胞所在的上室里的培液棄盡，把上室轉(zhuǎn)移至已經(jīng)接種有軟骨細(xì)胞的6孔板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，6 h后分別收集上室有和下室的培液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2儀器與試劑熒光倒置顯微鏡 （日本OLMYPUS公司）；細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（英國(guó)RSBiotech公司）；SC2-4A1ESCO生物安全柜（新加坡ESCO公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）；電泳儀（BIO-RAD POWER/ PAC 200）；低溫離心機(jī) （Centrifuge5810R）（德國(guó)Eppendorf公司）；BP-Ⅱ天平（上海光正公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏公司）；-80℃低溫冰箱（海爾公司）；搖床（TS-8）（上海精密儀器制造公司）；酶標(biāo)儀（Multisken MK3 Thermo）；超純水系統(tǒng)（德國(guó)Sartorious Stedim Biotech公司）；磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司，95-I）；電熱恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，UK-S22）。黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)：110781，規(guī)格20 mg，由上海東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)和質(zhì)量控制。滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Scien Cell公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；二甲基亞砜（上海凌峰化學(xué)試劑公司）；胞漿蛋白及核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液 （碧云天生物技術(shù)公司）；蛋白電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)（Pierce）；β-catenin抗體（CST）；山羊抗鼠HRP二抗 （Abcam）；HRP-ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Pierce）；MMP-7 ELISA試劑盒、COMP ELISA試劑盒、CTX-ⅡELISA試劑盒、（Cloud-clone）。

1.3觀察指標(biāo)1）Western blot檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后人滑膜細(xì)胞胞核和胞漿蛋白β-catenin的表達(dá)。共培養(yǎng)系統(tǒng)分為5組觀察，正?；ぜ?xì)胞為正常對(duì)照組，Wnt信號(hào)通路激活的滑膜細(xì)胞為通路激活組，12 h低、中、高劑量黃芪甲苷組，24 h低、中、高劑量黃芪甲苷組，48 h低、中、高劑量黃芪甲苷組。正常對(duì)照組和通路激活組給予0.9%氯化鈉溶液干預(yù)，12、24、48 h的低、中、高劑量黃芪甲苷組分別給予5%、10%、15%3種濃度的黃芪甲苷混懸液干預(yù)12、24、48 h［5］，干預(yù)完成后提取各組滑膜細(xì)胞胞核蛋白，Western blot檢測(cè)滑膜細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)情況。（1）胞漿蛋白與胞核蛋白的抽提：取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS輕輕洗滌2～3遍，小心刮下細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，離心，吸棄上清，向每20 μL細(xì)胞沉淀加入200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，劇烈振蕩15 s，冰上裂解10～15 min，低溫高速離心后所獲上清即為胞漿蛋白。向離心沉淀物 （含胞核蛋白）加入胞核洗滌液500 μL，洗滌1～2次；加入胞核裂解液150 μL震蕩混勻，冰上裂解10 min，低溫高速離心獲得上清即為胞核蛋白。（2）蛋白定量：根據(jù)碧云天BCA蛋白定量試劑盒（增強(qiáng)型）說(shuō)明對(duì)獲得的蛋白樣品進(jìn)行蛋白定量。（3）電泳：根據(jù)碧云天SDSPAGE電泳的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行配膠，上樣，電泳，以溴酚藍(lán)剛出膠底部時(shí)結(jié)束電泳。（4）轉(zhuǎn)膜：使用碧云天蛋白轉(zhuǎn)膜液45 V半干轉(zhuǎn)膜1.5 h。（5）封閉：膜放置于5%的脫脂奶粉或5%BSA封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床封閉1～2 h。（6）一抗孵育：5%BSA封閉液稀釋一抗至適當(dāng)濃度（β-catenin 1∶500，Tublin 1∶2000），采用膜倒貼法進(jìn)行抗體的孵育，搖床上室溫孵育1～2 h或4℃過(guò)夜。（7）洗膜：用TBST搖床上洗滌 3～4次，每次10 min。（8）二抗孵育：加入適量HRP標(biāo)記的二抗，搖床上室溫孵育0.5～1 h，洗膜同前，每次10 min。（9）顯影：暗室內(nèi)，根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce）操作方法進(jìn)行膜的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，觀察到熒光后進(jìn)行X光片壓片、顯影、定影。2）ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)人滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞上清液MMP-7、Ⅱ型膠原羧基端肽（CTX-Ⅱ）、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）的表達(dá)。正常對(duì)照組、通路激活組給予生理鹽水，黃芪甲苷組給予10%黃芪甲苷混懸液，干預(yù)通路激活的人滑膜細(xì)胞48 h后與正常人軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，分別收集共培養(yǎng)的人滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液。（1）標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 ng/mL 7個(gè)濃度。（2）加樣：酶標(biāo)板上分別設(shè)定所需的待測(cè)樣品蛋白孔，7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔及1～2個(gè)空白對(duì)照孔，各孔加入100 μL對(duì)應(yīng)液體，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃溫育2 h，吸棄殘液。（3）每孔加入檢測(cè)溶液A工作液（一抗）100 μL，蓋好覆膜，37℃溫育1 h，每孔加入300 μL洗滌液洗滌，重復(fù)4～5次。（4）每孔加入100 μL的B檢測(cè)（二抗）工作液，覆膜封好，37℃溫箱內(nèi)溫育30 min，洗板同前。（5）顯色：每個(gè)板孔內(nèi)加顯色底物90 μL，避光條件下37℃孵育顯色，孵育時(shí)間一般為15～30 min，標(biāo)準(zhǔn)品觀察到梯度顏色時(shí)加入終止液，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度（OD值）。（6）檢測(cè)計(jì)算：建立坐標(biāo)系，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，橫坐標(biāo)為OD值。繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品OD值計(jì)算樣品蛋白含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用PASW Statistics 20.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以（±s）的形式表示，組間差別采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，滿(mǎn)足球?qū)ΨQ(chēng)時(shí)，無(wú)需校正，不滿(mǎn)足球?qū)ΨQ(chēng)時(shí)采用ε校正系數(shù)校正后的結(jié)果，干預(yù)因素間無(wú)交互作用時(shí)分析其主效應(yīng)，有交互作用時(shí)分析其單獨(dú)效應(yīng)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的人滑膜細(xì)胞對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響見(jiàn)圖1。Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的人滑膜細(xì)胞與正常人軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，光鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，但是隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸受到抑制，軟骨細(xì)胞胞體邊緣與板壁接觸處發(fā)白，折光度增加，細(xì)胞貼壁強(qiáng)度降低，可能與細(xì)胞基質(zhì)降解有關(guān)。

圖1　Wnt信號(hào)通路激活的人滑膜細(xì)胞對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)的影響（200倍）

2.2各濃度黃芪甲苷混懸液不同時(shí)間干預(yù)后對(duì)Wnt/ β-catenin信號(hào)通路激活的人滑膜細(xì)胞胞核和胞漿蛋白β-catenin的影響見(jiàn)表1和圖2。正常人滑膜細(xì)胞胞核中未能明顯觀察到β-catenin蛋白表達(dá)，而通路激活組滑膜細(xì)胞胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)與正常人滑膜細(xì)胞相比顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。黃芪甲苷干預(yù)后滑膜細(xì)胞β-catenin表達(dá)與通路激活組比較均顯著降低，且β-catenin表達(dá)的降低程度與干預(yù)時(shí)間有一定關(guān)系，在48 h時(shí)表達(dá)最低，而中、高劑量間β-catenin表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.3黃芪甲苷對(duì)共培養(yǎng)人滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞上清液中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ表達(dá)的影響見(jiàn)表2～表4。通路激活組滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ蛋白濃度與正常對(duì)照組比較均明顯上調(diào)（P＜0.01）；與通路激活組相比均明顯下調(diào)（P＜0.01）。

表1　黃芪甲苷對(duì)共培養(yǎng)滑膜細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)的影響（±s）

表1　黃芪甲苷對(duì)共培養(yǎng)滑膜細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)的影響（±s）

與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與通路激活組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與48 h低劑量組比較，▲▲P＜0.01。下同。

組　別　n　β-catenin灰度值　倍數(shù)正常對(duì)照組　3　206.57±14.62　0.11±0.0076通路激活組　3　1917.46±80.28△△　1.00±0.0419 12 h低劑量組　3　2125.65±138.74　1.11±0.0724 12 h中劑量組　3　1815.06±101.03　0.95±0.0527 12 h高劑量組　3　1696.72±59.74　0.88±0.0312 24 h低劑量組　3　1791.19±177.52　0.93±0.0926 24 h中劑量組　3　1409.09±47.33**　0.73±0.0247 24 h高劑量組　3　1335.11±77.97**　0.70±0.0407 48 h低劑量組　3　2072.03±252.51*　1.08±0.1316 48 h中劑量組　3　821.83±75.16*▲▲　0.43±0.0392 48 h高劑量組　3　893.77±61.35*▲▲　0.46±0.0320

圖2　黃芪甲苷對(duì)共培養(yǎng)人滑膜細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)的影響

表2　共培養(yǎng)體系中滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-7的表達(dá)（±s）

表2　共培養(yǎng)體系中滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-7的表達(dá)（±s）

組正常對(duì)別　n　滑膜細(xì)胞上清液　軟骨細(xì)胞上照組　3　0.2582±0.0146　0.1326±0.0通路激活組　3　0.4582±0.0410△△　0.3360±0.0黃芪甲苷組　3　0.2920±0.0431**　0.1626±0.0清液224 163△△239**

表3　共培養(yǎng)體系中滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COMP的水平（±s）

表3　共培養(yǎng)體系中滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COMP的水平（±s）

組　別　n　滑膜細(xì)胞上清液　軟骨細(xì)胞上清液正常對(duì)照組　3　36.7553±2.0480　25.0720±3.0126通路激活組　3　71.8471±5.7680△　58.6446±0.9168△黃芪甲苷組　3　42.6342±2.7346**　33.5444±2.3082**

表4　共培養(yǎng)體系中滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CTX-Ⅱ的水平（±s）

表4　共培養(yǎng)體系中滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CTX-Ⅱ的水平（±s）

組　別　n　滑膜細(xì)胞上清液　軟骨細(xì)胞上清液正常對(duì)照組　3　2472.49±125.09　1342.20±131.33通路激活組　3　4544.73±352.31△　4053.71±69.996△黃芪甲苷組　3　2060.05±200.56**　1865.38±42.565**

3　討　論

KOA是一種退化性關(guān)節(jié)疾病，滑膜炎癥在KOA的發(fā)展機(jī)制中，是必不可少的重要因素之一，而且滑膜炎嚴(yán)重程度與KOA進(jìn)展之間存在相關(guān)性［6］。Wnt/βcatenin信號(hào)通路激活與骨關(guān)節(jié)滑膜炎形成密切相關(guān)［7］。國(guó)外研究顯示通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化［8］，國(guó)內(nèi)研究證明通過(guò)調(diào)控Wnt/βcatenin信號(hào)通路可以干擾OA軟骨細(xì)胞代謝［9］，起到保護(hù)軟骨細(xì)胞作用［10-12］。滑膜炎癥時(shí)可分泌MMPs、ADAMTS、IL-1、NO、TNF等酶和炎癥因子直接造成軟骨損傷［13］，無(wú)論是骨關(guān)節(jié)炎的早期還是晚期均存在明顯的滑膜炎癥，且與骨關(guān)節(jié)疼痛密切相關(guān)而反映關(guān)節(jié)退化程度［14］。軟骨基質(zhì)的降解嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的功能，關(guān)節(jié)組織和滑液中高水平的MMPs是造成軟骨基質(zhì)降解的重要因素［15］，而通過(guò)對(duì)MMPs的特異性強(qiáng)效抑制將會(huì)成為治療骨關(guān)節(jié)炎的重要靶點(diǎn)［16］。COMP和CTX-Ⅱ是軟骨基質(zhì)分解的產(chǎn)物，一些研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中CTX-Ⅱ水平在軟骨退變的早期階段顯著升高［17］，而即使在放射影像學(xué)正常的早期KOA中，血清COMP水平升高且與膝關(guān)節(jié)疼痛等臨床癥狀相關(guān)［18］，這可能是骨關(guān)節(jié)炎的滑膜炎造成的［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，10%的中劑量黃芪甲苷干預(yù)48 h對(duì)人滑膜細(xì)胞作用最為顯著，與既往研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［5］。結(jié)果表明黃芪甲苷能較好的降低通路激活的人滑膜細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)水平，且作用與藥物濃度與干預(yù)時(shí)間有關(guān)，其能在一定程度上抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路的激活，這可能是它抑制滑膜炎癥，調(diào)控關(guān)節(jié)微環(huán)境，抑制軟骨破壞而治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。黃芪甲苷能夠明顯降低滑膜細(xì)胞胞核中β-catenin水平且降低共培養(yǎng)體系異?；ぜ?xì)胞-軟骨細(xì)胞體系的MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ含量，這可能是黃芪甲苷通過(guò)抑制滑膜細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減輕滑膜炎癥，改善滑膜-軟骨微環(huán)境，抑制軟骨降解的分子機(jī)制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞共培養(yǎng)方法研究滑膜在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的滑膜細(xì)胞能直接造成軟骨基質(zhì)的分解代謝，并可能引起軟骨細(xì)胞代謝的異常，黃芪甲苷能夠較好的抑制滑膜細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路，降低滑膜-軟骨微環(huán)境中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ等表達(dá)，這可能是黃芪甲苷抑制滑膜炎癥、阻止軟骨基質(zhì)降解，促進(jìn)軟骨細(xì)胞功能恢復(fù)而治療膝骨關(guān)節(jié)炎的重要機(jī)制之一。但滑膜炎促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展更多的內(nèi)在機(jī)制尚需深入研究。

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Effect of AstragalosideⅣon MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP of Co-culture System of Chondrocytes and Human Synovial Cells Mediated by Wnt/β-catenin Signal Pathway

WANG Degang，XU Chuanyong，JIANG Yuxiang，et al.Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China.

R289.9

A

1004-745X（2016）05-0795-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.013

上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)科研項(xiàng)目（2014YSN64）；上海市教委創(chuàng)新課題（14YZ058）
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（電子郵箱：kanwb@126.com）

2015-12-29）