李　寧，張玉龍，林　濤，王繼良，劉宏程*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院，云南　昆明　650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南　昆明　650223)

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UPLC-MS法同時(shí)測(cè)定牛奶中磺胺類、喹諾酮類、甾體激素類及四環(huán)素類獸藥殘留

李寧1,2，張玉龍1,2，林濤2，王繼良1，劉宏程2*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南昆明650223)

建立并優(yōu)化了同時(shí)測(cè)定牛奶中10種磺胺類、6種喹諾酮類、8種甾體激素類以及1種四環(huán)素類藥物共25種獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品中目標(biāo)藥物經(jīng)5%乙酸乙腈提取，HLB固相萃取小柱凈化后，通過UPLC-MS測(cè)定，外標(biāo)法定量。25種獸藥在不同加標(biāo)濃度下的回收率為61.6%～119.2%，組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～13.4%，組間RSD為5.8%～14.2%，方法檢出限為0.5～2.0 μg/kg。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；牛奶；獸藥殘留；磺胺類；喹諾酮類；甾體激素類；四環(huán)素類

作為現(xiàn)代人們生活中不可或缺的食品之一，牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可和推崇。但部分生產(chǎn)者為了控制奶牛疾病，盲目而大量地使用各類獸藥，長(zhǎng)此以往造成細(xì)菌和病毒產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致只能增大劑量或同時(shí)使用多種藥物，形成了惡性循環(huán)。還有一些生產(chǎn)者為了增加產(chǎn)量和提高生產(chǎn)效率，對(duì)奶牛使用各種甾體激素類藥物，而該類藥物的脂溶性較大，易分泌進(jìn)入牛奶中，成為直接導(dǎo)致兒童性早熟及性發(fā)育異常的重要因素[1-2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告僅對(duì)5種甾體激素類藥物的殘留限量做出了規(guī)定[3]，鑒于生產(chǎn)者用藥的多樣性及復(fù)雜性，建立一種能夠同時(shí)快速測(cè)定多種獸藥殘留的分析檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

目前國(guó)內(nèi)牛奶中獸藥殘留的檢測(cè)方法大多是針對(duì)抗菌抗病毒藥物[4-9]，也有部分檢測(cè)甾體激素類藥物的報(bào)道[10-13]，但鮮有同時(shí)檢測(cè)抗菌藥物與甾體激素類藥物的方法，尤其是本實(shí)驗(yàn)中3類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類)廣泛使用的抗菌代表性藥物與危害性日漸增長(zhǎng)的甾體激素類藥物同時(shí)檢測(cè)的方法。

超高效液相色譜法因其分離效率高、柱效高、耗液少等優(yōu)點(diǎn)受到了研究者的青睞[14]。本研究采用的Waters QDa質(zhì)譜檢測(cè)器可與色譜分析儀器完美兼容，且經(jīng)過預(yù)先優(yōu)化，可在穩(wěn)定處理各種分析的同時(shí)降低意外共流出物或成分所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。該儀器方法將保留時(shí)間和質(zhì)譜分析相結(jié)合，為化合物鑒定提供了更優(yōu)的分析選擇性，可在無需高端質(zhì)譜儀的情況下提供分子信息和高質(zhì)量定性質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用SIR選擇性檢測(cè)模式可實(shí)現(xiàn)可靠的定量檢測(cè)。通過質(zhì)譜檢測(cè)分析確認(rèn)痕量成分，進(jìn)而提升分析的質(zhì)量和效率，實(shí)現(xiàn)完整快速的色譜分離及化合物鑒定，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)室藥品分析的工作流程。實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化建立了一種能夠同時(shí)快速測(cè)定多種抗菌藥物及甾體激素類藥物的分析檢測(cè)方法，給日常分析檢測(cè)工作提供借鑒的同時(shí)為國(guó)家制定食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法提供了參考。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Waters H-class超高效液相色譜儀、QDa質(zhì)譜儀、BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色譜柱均購(gòu)自美國(guó)Waters公司，電子天平(瑞士梅特勒公司)，渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)Organomation Associates)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)，乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制25種標(biāo)準(zhǔn)藥物儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱保存。

25種標(biāo)準(zhǔn)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確移取適量每種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液混合，用甲醇配成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱保存。

Na2EDTA緩沖溶液:準(zhǔn)確稱取1.29 g檸檬酸、1.09 g磷酸氫二鈉、3.72 g Na2EDTA-2H2O，加超純水90 mL溶解，用氫氧化鈉固體調(diào)至pH 6.0左右，定容至100 mL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品前處理樣品制備:購(gòu)于超市的純牛奶于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

提取:稱取5 g牛奶試樣于50 mL離心管中，加入5 mL Na2EDTA緩沖溶液(pH 6.0)，渦旋混勻1 min，45 ℃水浴超聲3 min，加入10 mL 5%乙酸乙腈和2 g氯化鈉、4 g無水Na2SO4，渦旋混勻1 min，超聲提取5 min，5 000 r/min高速離心5 min，取上清液待凈化。

凈化:移取上清液于10 mL具刻度玻璃管中，40 ℃下氮?dú)鉂饪s至近干，加入5 mL 緩沖液溶解稀釋，待上樣。HLB固相萃取小柱依次經(jīng)6 mL甲醇、6 mL水、3 mL緩沖溶液活化，取稀釋液上樣，6 mL水淋洗，正壓擠干或負(fù)壓抽干小柱，8 mL甲醇-乙酸乙酯洗脫液(3∶7)洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮?dú)鉂饪s吹干，1 mL甲醇定容，渦旋混勻1 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.3超高效液相色譜-質(zhì)譜條件超高效液相色譜條件:C18高效液相色譜柱(Waters BEH C181.7 μm×2.1 mm×50 mm)；載氣為高純氮?dú)?≥99.999%)；流動(dòng)相:A為甲醇，B為含10 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；梯度洗脫步驟為:0～1 min，0～10%A；1～6 min，10%～60%A；6～7 min，60%～80%A；7～8 min，80%～10%A。

質(zhì)譜條件:檢測(cè)器:Waters QDa質(zhì)譜儀；離子源:ESI源；掃描方式:正離子SIR掃描；掃描質(zhì)量數(shù)范圍為m/z30～500；采樣速率8點(diǎn)/s；毛細(xì)管電壓:0.8 kV；錐孔電壓:15 V。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選用BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色譜柱分離目標(biāo)化合物以達(dá)到有效分離的目的。由于磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物均呈酸堿兩性，流動(dòng)相pH值對(duì)保留和分離的影響大。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水和乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)的峰形和響應(yīng)，以及甲酸、甲酸銨和乙酸銨的離子化效率，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%甲酸水溶液(含1 mmol/L乙酸銨)作流動(dòng)相時(shí)離子化效率高，峰形好，響應(yīng)較高(見圖1)。酸度過低會(huì)出現(xiàn)峰拖尾，過高則分離效果差。

本實(shí)驗(yàn)采用Waters QDa質(zhì)譜檢測(cè)器，操作簡(jiǎn)便，能夠降低共流出物或基質(zhì)本身的干擾，雖然靈敏度與三重四極桿質(zhì)譜儀有一定的差距，但與紫外檢測(cè)器相比，能夠明顯減少雜質(zhì)峰，同時(shí)可在較短的時(shí)間內(nèi)完成儀器的自檢及調(diào)諧，快捷方便，基本能滿足常規(guī)檢測(cè)要求。

2.2提取條件的優(yōu)化

目標(biāo)化合物均易溶于丙酮、乙腈等非極性或中等極性溶劑，而乙腈具有較好的蛋白沉淀作用，有利于提取，因此選用乙腈作為提取溶劑，且以5%酸化乙腈對(duì)目標(biāo)化合物的提取更優(yōu)。當(dāng)僅用酸化乙腈提取時(shí)發(fā)現(xiàn)喹諾酮類和四環(huán)素類藥物基本未檢出，這是由于喹諾酮類藥物分子結(jié)構(gòu)中的3-羧基和4-羰基可與Ca2+,Mg2+,Al3+,Zn2+等金屬離子螯合，四環(huán)素類藥物同樣容易與金屬離子螯合而影響提取效果，所以考慮加入EDTA緩沖溶液。一方面EDTA緩沖液可與基質(zhì)中的金屬離子螯合而使目標(biāo)化合物分布到有機(jī)相中，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲水浴30～40 ℃對(duì)EDTA和金屬離子的螯合置換過程有一定幫助；另一方面，緩沖溶液起到了稀釋基質(zhì)的作用，一定程度上減小了基質(zhì)效應(yīng)的影響。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)緩沖溶液的pH值對(duì)提取效果有很大影響，分別考察了pH 4.0，7.0，9.0時(shí)的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于磺胺、喹諾酮和四環(huán)素均屬于兩性化合物，因此過酸和過堿都不利于提取，而pH值對(duì)雌激素的影響則較小。此外，酸堿環(huán)境對(duì)3類化合物的影響大小也不同，其中酸性環(huán)境對(duì)于磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的影響大于堿性環(huán)境，而四環(huán)素類藥物則反之。在近中性條件下，目標(biāo)化合物更易與金屬離子形成不溶性絡(luò)合物，因此最終選擇pH 6.0的EDTA緩沖溶液進(jìn)行后續(xù)考察。

2.3凈化條件的優(yōu)化

2.4線性范圍與檢出限

在最佳儀器條件下，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以定量離子峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛奶空白基質(zhì)進(jìn)行檢出限(LOD=3m1h0/(m0h1)，m1和h1分別表示加標(biāo)量和化合物峰高；m0和h0分別表示牛奶基質(zhì)量和基線高度)和定量下限(LOQ=3LOD)計(jì)算，結(jié)果如表1所示。25種目標(biāo)藥物在1～50 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，LOD為0.5～2.0 μg/kg，LOQ為1.5～6.0 μg/kg。

表1　25種目標(biāo)藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.5回收率與精密度

以鮮牛奶和普通牛奶進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，分別以1LOQ,5LOQ和10LOQ作為加標(biāo)水平，每個(gè)水平平行試驗(yàn)6次，結(jié)果如表2所示。25種目標(biāo)藥物的平均回收率為61.6%～119.2%，組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～13.4%，組間RSD為5.8%～14.2%。鮮牛奶的回收率普遍低于普通純牛奶，分析其原因可能與蛋白量、含鈣量等基質(zhì)成分有關(guān)，但基本滿足日常分析對(duì)牛奶中目標(biāo)藥物的測(cè)定要求。

表2　25種獸類藥物不同加標(biāo)水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

(續(xù)表2)

2.6實(shí)際樣品的測(cè)定

隨機(jī)抽取在售的鮮牛奶和純牛奶各18份，采用本方法測(cè)定，在1份純牛奶樣品中檢出磺胺間二甲氧嘧啶21.5 μg/kg，1份純牛奶樣品中檢出磺胺甲基嘧啶10.6 μg/kg、恩諾沙星15.3 μg/kg，但均未超過我國(guó)農(nóng)業(yè)部限量標(biāo)準(zhǔn)；1份鮮牛奶樣品中檢出孕酮4.5 μg/kg，我國(guó)農(nóng)業(yè)部未對(duì)其作出限量規(guī)定，但未超過美國(guó)規(guī)定的5 μg/kg限量標(biāo)準(zhǔn)，其他樣品未見檢出。

3　結(jié)　論

本研究建立了牛奶中10種磺胺類、6種喹諾酮類、8種甾體激素類和1種四環(huán)素類共25種獸類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，優(yōu)化了固相萃取法的樣品前處理?xiàng)l件。該方法操作較簡(jiǎn)便，靈敏度高，可滿足牛奶中25種獸類藥物的痕量分析要求，尤其適于實(shí)驗(yàn)室外的分析檢測(cè)。

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Analysis of Sulfonamide,Quinolones,Steroid Hormones and Tetracyclines Residues in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LI Ning1,2，ZHANG Yu-long1,2，LIN Tao2，WANG Ji-liang1，LIU Hong-cheng2*

(1.School of Pharmaceutical Science,Kunming Medical University,Kunming650500,China；2.Institute of Agricultural Quality Standard & Testing Technique,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming650223,China)

A comprehensive method was developed and optimized for the simultaneous analysis of sulfonamides,quinolones,steroid hormones and tetracycline by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS).The veterinary drugs in milk samples were extracted with 5% acetic acid-acetonitrile solution,and then the mixture was centrifuged.The supernatant was purified with an HLB solid phase extraction column,and analysed by UPLC-MS and quantified by the external standard method.Average recoveries of 25 veterinary drugs at three spiked levels ranged from 61.6% to 119.2% with relative standard deviations(RSDs) of 2.5%-13.4%.The method limits of detection(LOD) for target compounds were in the range of 0.5-2.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS);milk;veterinary drugs residues；sulfonamides;quinolones；steroid hormones;tetracycline

2015-11-25；

2015-12-16

云南省科技惠民計(jì)劃(2013RA012)；云南省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃(2014DA001)

劉宏程，博士，研究員，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，Tel:0871-65160403，E-mail:liuorg@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.014

O657.63;O629.8

A

1004-4957(2016)06-0714-05