阮　磊　夏能志　楊運俊溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，浙江溫州　325000

基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)在腦梗死中的研究進(jìn)展

阮磊夏能志楊運俊▲
溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，浙江溫州325000

腦梗死是缺血性腦血管病的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，其致殘、致死及復(fù)發(fā)率均較高。近年來隨著神經(jīng)影像技術(shù)的不斷發(fā)展，腦梗死的影像學(xué)研究正由傳統(tǒng)的大體形態(tài)學(xué)向功能、分子水平轉(zhuǎn)變?；诤舜殴舱竦拇x組學(xué)技術(shù)在腦梗死中的逐漸應(yīng)用，使得人們對腦梗死的研究深入到細(xì)胞代謝水平，對于理解腦梗死的病理生理變化、診斷、預(yù)后和療效的判斷均有重要意義。因此，本文基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)在腦梗死研究方面的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

代謝組學(xué)；腦梗死；細(xì)胞代謝；核磁共振

［Abstract］Cerebral infarction is a serious form of ischemic cerebrovascular disease and has high disability，mortality and recurrence rate.With the development of neuroimaging techniques in recent years，the imaging study of cerebral infarction is changing from the tradition general morphology to the function and molecular levels.The gradual application of nuclear magnetic resonance（NMR）-based Metabonomics on cerebral infarction makes the study of cerebral infarction deeper into the level of cell metabolism，and has great significance in understanding the pathophysiology，diagnosis，prognosis and curative effect of cerebral infarction.Therefore，this article reviewed the progress of NMR-based Metabonomics on cerebral infarction research.

［Key words］Metabonomics；Cerebral infarction；Cell metabolism；Nuclear magnetic resonance（NMR）

代謝組學(xué)（Metabonomics）是指通過定性定量分析生物體系受刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物的變化，敘述機體在內(nèi)外環(huán)境變化后代謝過程的動態(tài)反應(yīng)規(guī)律，從而研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興組學(xué)［1，2］。Nicholson等［1，3］于 1999年首次提出“Metabonomics”的概念，認(rèn)為代謝組學(xué)能檢測、識別和量化整個生物系統(tǒng)而不是單個細(xì)胞的代謝變化，并利用NMR在疾病診斷、藥物篩選等方面做了大量的研究工作。隨后，F(xiàn)iehn等［4］根據(jù)研究的對象和目的不同，將對生物體系的代謝產(chǎn)物分析分為4個層次：①代謝物靶標(biāo)分析；②代謝輪廓分析；③代謝組學(xué)分析；④代謝物指紋分析。代謝組學(xué)研究的對象大多是相對分子質(zhì)量為1000以下的小分子代謝物，其在生物醫(yī)學(xué)的主要分析技術(shù)包括核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)中生物標(biāo)志物的研究受到廣泛關(guān)注，而基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)是代謝組學(xué)普遍采用的方法［5，6］。

研究表明，我國約有700萬腦卒中患者，且發(fā)生率正以每年8.7%的速度上升，每年用于治療腦卒中的費用高達(dá)數(shù)百億元人民幣，給患者家庭和社會造成沉重的負(fù)擔(dān)［7-9］。其中缺血性腦卒中約占60%～80%，而腦梗死是其嚴(yán)重表現(xiàn)形式［10］。缺血腦組織的損傷機制非常復(fù)雜，涉及病理生理、生化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種改變，近年來隨著神經(jīng)影像技術(shù)的不斷發(fā)展，腦梗死的影像學(xué)研究正由傳統(tǒng)的大體形態(tài)學(xué)向功能、分子水平轉(zhuǎn)變。因此了解缺血腦的組織分子代謝水平的變化規(guī)律，對于輔助臨床診斷及判斷疾病預(yù)后和治療效果均有非常重要的意義。

1　基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)

基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)主要是利用高磁場中原子核對射頻輻射的吸收光譜鑒定體液中化合物結(jié)構(gòu)，通過檢測一系列樣品的NMR譜圖，再結(jié)合模式識別方法，對生物體的體液和組織進(jìn)行系統(tǒng)測量和分析，對完整的生物體中隨時間改變的代謝物進(jìn)行動態(tài)跟蹤檢測、定性定量，然后將這些代謝信息與病理生理過程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來，可以判斷出生物體的病理生理狀態(tài)，并有可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物［1，3］。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，NMR已成為測定分子結(jié)構(gòu)最有效的工具之一，其可以測定多種核素，如1H、2H、13C、17O、19F、14N、15N、31P、23Na、39K等，其中最常用的核素是1H、13C和31P［11，12］。由于NMR所需樣本用量小、無需分離技術(shù)，基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛用于藥物毒理性評定、生物信息學(xué)研究、代謝性疾病、腫瘤學(xué)等的檢測［13］。近年來，隨著代謝物波譜數(shù)據(jù)庫的建立和完善，樣品中代謝物的鑒定將變得更加容易。

基于NMR的代謝組學(xué)研究中采集得到的是多維的、大量的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理一般遵循以下步驟［14］：①NMR譜圖采集，并校正基線和相位；②譜圖預(yù)處理，包括歸一化、分段積分和尺度標(biāo)準(zhǔn)化處理；③采用模式識別方法進(jìn)行聚類分析和生物標(biāo)志物的識別。主成分分析經(jīng)過SIMCA軟件處理后，可以得到得分圖和載荷圖兩種分布圖。從得分圖上可觀察樣品的離散、聚集程度，還能反映樣品隨時間的動態(tài)變化過程。樣品分布點越集中，說明這些樣品中所含有的變量/分子的組成和濃度越接近，反之則差異越大。在載荷圖中，變量分布與得分圖中的樣品分布和位置相對應(yīng)，表示所檢測的變量（如NMR中的化學(xué)位移）分布情況。然而載荷圖只能粗略尋找差異化合物，若要確定化合物之間差異的顯著性，則須借助相應(yīng)的統(tǒng)計分析方法。

2　缺血腦組織的代謝物變化

腦梗死發(fā)生時會出現(xiàn)腦代謝障礙，造成線粒體有氧代謝中斷、ATP生成減少，從而導(dǎo)致葡萄糖通過無氧酵解產(chǎn)生乳酸（Lactate，Lac）供能，而另一種能量儲存方式的磷酸肌酸亦分解成肌酸（Creatine，Cr）供能［15］。此外，N-乙?；於彼幔∟-acetyl aspartate，NAA）、膽堿（Choline，Cho）、谷氨酸（Glutamate，Glu）、谷氨酰胺（Glutamine，Gln）、γ-氨基丁酸 （Gamma-Amino-Butyric Acid，GABA）、丙氨酸 （Alanine，Ala）、甘氨酸（Glycine，Gly）、天冬氨酸（Aspartate，Asp）、肌醇（myo-Inositol，m-Ins）、琥珀酸（Succinate，Suc）、?；撬幔═aurine，Tau）等腦內(nèi)代謝物均會發(fā)生相應(yīng)變化。通過在體或離體NMR分析腦梗死后代謝物的變化，對研究腦梗死的發(fā)病和預(yù)后具有重要的醫(yī)學(xué)價值和社會價值。

2.1NAA

NAA主要存在于成熟的神經(jīng)元胞體和軸突內(nèi)，在神經(jīng)元線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)由天門冬氨酸和乙酰輔酶A合成，是腦內(nèi)含量僅次于Glu的氨基酸衍生物，通常位于譜圖的2.02 ppm處，是正常人腦MRS中的最高峰。這種高峰信號還包含一小部分其他乙?；旌衔镄盘枺热鏝-乙酰天門冬氨酰谷氨酸（NAAG）、N-乙酰神經(jīng)氨酸。NAA反映神經(jīng)元的密度和活性狀態(tài)，可能與神經(jīng)元的滲透壓調(diào)節(jié)、軸突-膠質(zhì)細(xì)胞間信號傳遞有關(guān)［16，17］。在急性腦梗死患者中，NAA含量降低常被認(rèn)為是缺血后腦損傷的標(biāo)志，其降低的水平反映了缺血腦組織損傷的嚴(yán)重程度，即降低的程度越大表明丟失的神經(jīng)元越多［18］。多數(shù)研究表明，腦梗死患者梗死核心NAA于超急性期出現(xiàn)輕度下降，急性期顯著下降，慢性期下降達(dá)最低水平，標(biāo)志著腦神經(jīng)元出現(xiàn)了不可逆性損傷［19］。急性期NAA的降低可能是由于NAA的合成減少和分解增加所致。有臨床試驗表明，NAA下降率為0.67 μg/（kg·h），高于正常成人腦中NAA的合成速率0.55 μg/（kg·h）［20］。同時，由于NAA的合成是ATP依賴性的，能量的缺乏會使NAA持續(xù)降低。Munoz等［21］對51例急性腦缺血患者進(jìn)行1H-MRS檢查發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)和缺血周圍組織的NAA進(jìn)行性下降，表明神經(jīng)損傷從缺血發(fā)生后到2周甚至更長時間可持續(xù)存在。Lei等［22］對缺血30 min后再灌注小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，缺血側(cè)紋狀體的NAA含量在缺血后3 h顯著降低，且缺血24 h仍然顯著減少。

有研究顯示，NAA與梗死面積及臨床預(yù)后相關(guān)，一般大面積梗死患者NAA降低程度較小面積梗死者更嚴(yán)重，而NAA的恢復(fù)或升高可能預(yù)示好的預(yù)后［23，24］。Brulatout等［25］利用在體NMR對全腦缺血30 min后再灌注大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，NAA先呈顯著降低，恢復(fù)灌注后再逐漸恢復(fù)。NAA降低程度通常較Cho和Cr更大，可能是因為腦梗死區(qū)神經(jīng)元較膠質(zhì)細(xì)胞對缺血更敏感，當(dāng)神經(jīng)元功能受損時，膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整［26］。

2.2Lac

Lac是無氧糖酵解的產(chǎn)物，被認(rèn)為是腦梗死開始階段最敏感的標(biāo)志物［6，27］。當(dāng)譜圖中出現(xiàn)Lac峰時，常提示腦組織存在缺血、缺氧，腦細(xì)胞有氧代謝障礙而無氧糖酵解加強。腦缺血剛發(fā)作時Lac含量最高，其反映存活神經(jīng)元的代謝紊亂而非神經(jīng)元的壞死情況［24］。腦缺血后Lac含量的升高可分為兩個階段：第一個階段是腦組織缺血缺氧后的無氧酵解，第二個階段于再灌注后1 h開始增加并可持續(xù)到再灌注72 h。后者Lac含量的升高可能是由于膠質(zhì)細(xì)胞Lac代謝的增加所致［28］。腦梗死后Lac可從急性期到慢性期持續(xù)升高，可作為慢性腦缺血的標(biāo)記。Lac的持續(xù)升高可能是因為Lac隨梗死區(qū)細(xì)胞的溶解而緩慢擴散，或由缺血半暗帶神經(jīng)元及滲入的炎性細(xì)胞產(chǎn)生。Lac的升高程度與缺血程度和血液中葡萄糖濃度有關(guān)。有研究表明，低血糖能阻止大鼠腦缺血再灌注導(dǎo)致的乳酸增加，可能是低血糖能減少缺血后代謝的負(fù)擔(dān)，而且低血糖對缺血后游離脂肪酸和興奮性氨基酸水平的影響較?。?9］。Lac在缺血數(shù)天后會被清除，而其持續(xù)升高也可能源于其合成和清除的失衡［30］。然而，這種持續(xù)性升高并非絕對的。Gideon等［31］利用MRS對腦梗死患者的長期隨訪發(fā)現(xiàn)，Lac可以在腦缺血后1～4周降低，而在7～15個月的慢性期又重新出現(xiàn)。

急性期Lac含量升高和NAA水平降低可反映梗死核心的形成。Henriksen等［32］研究急性期Lac和相對腦血流量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，兩者成反向關(guān)系，且Lac在缺血區(qū)分布不均，梗死核心Lac比梗死周圍區(qū)含量高。研究表明，NAA與Lac的綜合分析對于區(qū)別梗死核心與腦缺血半暗帶有重要的價值，NAA顯著降低、Lac明顯升高的區(qū)域可能為不可逆損傷區(qū)，而Lac顯著升高、NAA正常或輕度下降的區(qū)域可能為腦缺血半暗帶［33］。

2.3Cho和Cr

既往臨床研究常以Cho和Cr作為參照物，來計算NAA和Lac的相對濃度，其認(rèn)為腦梗死患者Cho和Cr的濃度不會發(fā)生顯著變化［34，35］。但近年來國內(nèi)外多數(shù)研究表明，Cho和Cr在腦梗死時并不是恒定不變的，不同腦梗死時期其濃度不同。有研究發(fā)現(xiàn)，Cr在腦梗死后3個月持續(xù)降低，而Cho在腦梗死后2周明顯降低，隨后逐漸上升至正常水平［36］。Cho主要存在于細(xì)胞膜，是細(xì)胞膜和鞘磷脂的標(biāo)志物。譜圖上Cho峰由磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿、游離膽堿構(gòu)成，其峰值高低取決于膜磷脂和神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的濃度。Cho濃度升高表明細(xì)胞膜合成增加或細(xì)胞數(shù)量增加，降低則表明細(xì)胞膜的破壞［37］。

譜圖上的Cr峰由肌酸和磷酸肌酸共同構(gòu)成，其存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)磷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和能量緩沖系統(tǒng)的標(biāo)志物［38］。作為一種能量儲備形式，Cr在ATP不足時參與機體供能，對于維持細(xì)胞能量代謝起著重要作用。Cr在缺血24 h后開始降低，可持續(xù)降低到缺血后96 h［18］，提示超急性期由于腦缺血而出現(xiàn)明顯的能量代謝障礙，從而導(dǎo)致高能磷酸代謝物減少，說明神經(jīng)元對缺血的反應(yīng)非常敏感。研究表明，腦梗死超急性期Cr開始顯著下降，隨著梗死時間延長，急性期至亞急性期Cr逐步降低，至慢性期降到較低水平。腦梗死患者Cr與NAA下降趨勢基本保持一致，但Cr下降程度不及NAA明顯［39］。有研究表明，NAA/Cr和Cho/Cr可反映缺血性腦白質(zhì)損傷患者的認(rèn)知功能障礙情況，重度認(rèn)知障礙患者NAA/Cr和Cho/Cr降低，而對輕中度認(rèn)知障礙患者，NAA/Cr降低而Cho/Cr明顯增加［40］。

2.4Glu、Gln和GABA

Glu、Asp是興奮性氨基酸，對神經(jīng)元有興奮作用，然而其濃度過高則可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用；GABA和Gly是抑制性氨基酸，能抑制神經(jīng)興奮，在一定程度上可抵消興奮性神經(jīng)毒性作用［41，42］。通常情況下，機體中興奮性氨基酸和抑制性氨基酸處于一個動態(tài)平衡之中［43］。有研究表明，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間存在Gln-Glu-GABA循環(huán)，即神經(jīng)元釋放至胞外的Glu可被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞吸收，在谷氨酰胺合成酶的作用下轉(zhuǎn)化成Gln，然后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的Gln被轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元中被谷氨酰胺酶水解成Glu，此外在GABA能神經(jīng)元中，Glu在谷氨酸脫羧酶的作用下形成GABA。Glu雖然是腦內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但是體內(nèi)合成的谷氨酸卻不能通過血腦屏幕，所以只能通過Gln-Glu途徑產(chǎn)生的Glu才能作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。

在缺血條件下Glu含量急劇升高，致使神經(jīng)元上非N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體活化、鈉離子通道開放，造成大量鈉離子內(nèi)流，引起細(xì)胞腫脹［44］。同時過量的Glu還可活化NMDA受體，促使鈣通道開放，鈣離子大量內(nèi)流造成鈣超載，神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重受損，甚至死亡。腦內(nèi)谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性是腦缺血性損傷的主要因素，而且缺血改變了星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間Gln-Glu循環(huán)，梗死核心的膠質(zhì)細(xì)胞由于缺氧而不能將細(xì)胞外積累的Glu轉(zhuǎn)化為Gln，抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞對Glu的吸收，導(dǎo)致Glu濃度進(jìn)一步升高［45］。有實驗研究表明，Glu在缺血后2 h含量達(dá)到最高，MRS聯(lián)合ADC、DWI可通過定量分析代謝物的濃度評估超急性期腦缺血發(fā)作時間［46］。

2.5其他

m-Ins普遍存在于膠質(zhì)細(xì)胞中，對維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓的穩(wěn)定起重要作用，是膠質(zhì)細(xì)胞功能受損的敏感標(biāo)志物［6］。Tau也主要存在于膠質(zhì)細(xì)胞中，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，有保護(hù)和調(diào)節(jié)神經(jīng)的作用，可以促進(jìn)神經(jīng)元增殖和分化［42］。Suc是三羧酸循環(huán)中的重要物質(zhì)，同時參與Glu-GABA-Suc代謝旁路，即除了參與能量代謝循環(huán)外，還參與Glu及GABA的平衡［47］。Ala是體內(nèi)非必需氨基酸，存在諸多代謝途徑，在酶的催化下可轉(zhuǎn)變?yōu)楸釁⑴c糖酵解，且與Glu互為可逆反應(yīng)。

腦缺血可導(dǎo)致三羧酸循環(huán)、糖酵解、氨基酸、磷脂和核苷酸代謝等代謝變化，基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)已成為分析腦缺血代謝物變化的有力檢查手段。通過1H-MRS檢測腦缺血各階段的代謝標(biāo)記物的變化對腦梗死的診斷、治療和預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。

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圖1　基本特征生存率差異（見內(nèi)文第5頁）

圖2　RSF迭代過程（見內(nèi)文第5頁）

圖4　EVS指導(dǎo)下EMR切除食管黏膜肌層平滑肌瘤

（見內(nèi)文第76頁）

圖3　基因調(diào)控關(guān)系

（見內(nèi)文第5頁）

Advancement of NMR-based Metabonomics on cerebral infarction research

RUAN LeiXIA NengzhiYANG Yunjun
Department of Radiology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China

圖5　牽拉性視網(wǎng)膜脫離（見內(nèi)文第108頁）

圖6　病理膜上可見造影劑通過（見內(nèi)文第108頁）

R445.2；R743.33

A

1673-9701（2016）17-0164-05

浙江省溫州市科技計劃項目（Y20140731）；浙江省溫州市科技計劃項目（Y20150087）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（2014KYA134）；浙江省自然科學(xué)基金（LY15H220001）▲

（2016-03-12）