徐　妍　嚴(yán)　旺　蔡雅衛(wèi)　王繼業(yè).寧波市第二醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，浙江寧波　500；2.寧波市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江寧波　500；.浙江警察學(xué)院，浙江杭州　005

異鉤藤堿通過mTOR非依賴性途徑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬發(fā)生

徐妍1嚴(yán)旺2▲蔡雅衛(wèi)1王繼業(yè)3
1.寧波市第二醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，浙江寧波315010；2.寧波市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江寧波315010；3.浙江警察學(xué)院，浙江杭州310053

目的 探討異鉤藤堿（Isorhynchophylline，IRN）人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞自噬的發(fā)生及其與mTOR信號(hào)通路的關(guān)系。方法 用不同濃度IRN（6、12和24 μmol/L）處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，免疫印跡法檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)，免疫熒光法觀察微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）熒光斑點(diǎn)標(biāo)記的自噬體形成，利用溶酶體穩(wěn)定劑氯喹（CQ）以及自噬抑制劑3-MA進(jìn)一步明確IRN作用的途徑。Western蛋白印跡法檢測(cè)mTOR相關(guān)蛋白和Beclin1的表達(dá)。結(jié)果IRN作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，可顯著上調(diào)LC3-Ⅱ表達(dá)，0、6、12、24 μM IRN作用后的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.086±0.02）、（0.39±0.14）、（0.96±0.09）、（1.93±0.14）。自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高（P＜0.01），并呈濃度依賴性，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3熒光斑點(diǎn)標(biāo)記的自噬體增多，在IRN不同濃度處理組（0、6、12、24 μM）中分別為2±1/細(xì)胞，4±1/細(xì)胞，8±1/細(xì)胞，和14±2/細(xì)胞。IRN聯(lián)合CQ后可以促進(jìn)LC3-Ⅱ的表達(dá) （0.64±0.052）。IRN可以削弱a-Syn蛋白表達(dá)，在0、6、12、24 μM組中的相對(duì)表達(dá)量為 （0.71±0.07）、（0.69± 0.05）、（0.53±0.04）、（0.36±0.034），并呈濃度依賴性，聯(lián)合3-MA后a-Syn表達(dá)上調(diào)（0.63±0.04），提示3-MA可以逆轉(zhuǎn)由IRN對(duì)a-Syn的抑制效果，而CQ對(duì)a-Syn表達(dá)，與對(duì)照組比無顯著影響。信號(hào)通路研究提示，對(duì)mTOR以及Beclin1表達(dá)不影響，Beclin1特異性siRNA作用后可以抑制IRN誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)。 結(jié)論IRN可誘導(dǎo)SHSY5Y細(xì)胞自噬的發(fā)生，其機(jī)制為mTOR非依賴性自噬途徑，Beclin1的表達(dá)可以影響IRN誘導(dǎo)的自噬。

異鉤藤堿；SH-SY5Y細(xì)胞；自噬；Beclin1

［Abstract］Objective To explore the relationship between the occurrence of autophagy of human glioma cell SH-SY5Y induced by isorhynchophylline（IRN）and mTOR signaling pathway.Methods SH-SY5Y cells were treated by IRN with different concentrations（6，12 and 24 μmol/L）for 24h，and Western Blot method was used to test the expression of marker protein of autophagy LC3-Ⅱ.Immumofluorescence method was used to observe the formation of autophagosome marked by fluorescent spots in microtubule-associated protein LC3.Lysosome stabilizer CQ，and autophagy inhibitor 3-MA were used to further identify the action pathway of IRN.Western Blot method was used to test the expression of mTOR-associated proteins and Beclin1.Results After SH-SY5Y cells were treated by IRN，the expression of LC3-Ⅱwas significantly up-regulated.The relative expression amount after the action of 0，6，12 and 24 μM IRN was（0.086± 0.02），（0.39±0.14），（0.96±0.09），and（1.93±0.14）respectively.The ratio of autophagy-associated proteins LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwas increased（P＜0.01），showing concentration dependence.Autophagosome marked by GFP-LC3 fluorescent spots were increased in SH-SY5Y cells，and was 2±1/cell，4±1/cell，8±1/cell and 14±2/cell respectively in the IRN treatment groups with different concentrations（0，6，12，24 μM）.IRN combined with CQ was able to promote the expression of LC3-II（0.64±0.052）.IRN was able to reduce the expression of a-Syn protein.The relative expression amount in 0，6，12 and 24 μM groups were（0.71±0.07），（0.69±0.05），（0.53±0.04），and（0.36±0.034）respectively，showing concentration dependence.After the combination with 3-MA，a-Syn expression was up-regulated（0.63±0.04），indicating that 3-MA was able to reverse the inhibiting effects of IRN on a-Syn.The effects of CQ on the expression of a-Syn were not sig-nificant compared with the control group.The study on signaling pathway indicated that the expression of mTOR and Becline1 was not affected，and with the action of Beclin1-specific siRNA，the expression of LC3-Ⅱinduced by IRN could be inhibited.Conclusion IRN is able to induce the occurrence of autophagy of SH-WY5Y cells，and the mechanism is independent autophagy pathway of mTOR.The expression of Beclin1 is able to affect the autophagy induced by IRN.

［Key words］Isorhynchophylline；SH-SY5Y cells；Autophagy；Beclin1

細(xì)胞自噬是常見的生物學(xué)現(xiàn)象，是對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的高度保守的生理過程，通過降解胞漿內(nèi)細(xì)胞器，長(zhǎng)壽命蛋白和有聚集傾向的蛋白，進(jìn)而滿足細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的需求，一定意義上也是細(xì)胞在饑餓或者環(huán)境壓力下的一種自然生理過程。有多種神經(jīng)退行性疾病與細(xì)胞內(nèi)某些蛋白的異常聚集有關(guān)，如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson Disease，PD）和亨廷頓病疾病屬于神經(jīng)變性疾病，這些疾病的發(fā)生在一定程度上與大腦受累區(qū)域中異常蛋白的過度積聚有關(guān)。比如像a-突觸核蛋白（a-Syn）的過度表達(dá)與和家族型帕金森的發(fā)生密切相關(guān)［1］。a-Syn的點(diǎn)突變則可以增加其聚集傾向，并可導(dǎo)致家族性PD的早期發(fā)病，在小鼠的研究中同時(shí)也驗(yàn)證了過量表達(dá)的a-Syn可以導(dǎo)致腦神經(jīng)中多巴胺能神經(jīng)元的喪失，以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)包涵體的形成，并最終導(dǎo)致進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)缺陷，普遍認(rèn)為a-Syn寡聚體的積累或包涵體的形成會(huì)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性，最終可以導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞直接死亡。此外，在老年癡呆患者中往往有Tau蛋白的過量聚集，Tau蛋白的過度磷酸化與AD發(fā)病的相關(guān)性密切［2］。目前認(rèn)為，a-Syn、Tau蛋白以及其他類似的可以引起神經(jīng)退行性病變的寡聚蛋白極大程度上依賴于細(xì)胞自噬途徑的清除，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)的體積往往較大，無法通過蛋白酶體的狹窄核心進(jìn)行降解。

異鉤藤堿（Isorhynchophylline，IRN）是從茜草科中藥鉤藤抽取提的具有較強(qiáng)藥理活性的羥吲哚生物堿，除已被臨床應(yīng)用于治療心血管疾病外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的藥理學(xué)作用，存在多種生物活性，比如對(duì)缺血誘導(dǎo)引起的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用［3］；抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放［4］；顯著降低大腦皮層的興奮性，具有明顯的鎮(zhèn)靜、安眠、降壓、解痙等作用，是安神養(yǎng)血口服液中的主要成分之一［5］，這些研究都從不同角度說明IRN可以較好通過血腦屏障而影響腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞［6］。目前尚無IRN在自噬方面的研究。本項(xiàng)目在2014年12月～2015年12月開展，著重考察IRN對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響，探討IRN是否可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬性以及相關(guān)機(jī)制分析。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑和主要儀器

神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。新生牛血清，DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自美國(guó)Life technology公司；異鉤藤堿購自美國(guó)Sigma公司；mTOR通路相關(guān)抗體，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗人自噬微觀相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3）抗體，p62抗體，兔抗人Beclin1抗體，以及二抗均購自Abcam；mTOR以及P70S6K磷酸化抗體購自CST公司；底物化學(xué)發(fā)光試劑，F(xiàn)luor Save抗熒光淬滅劑，3-MA（3-Methyladenine）以及氯喹（CQ）均購自美國(guó)Millipore公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青-鏈霉素霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含有5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中，每隔2～3天換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SH-SY5Y細(xì)胞以1×104/mL密度接種于6孔或12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，IRN配置成10 mM儲(chǔ)液，使用時(shí)用完全培養(yǎng)稀釋，加入到細(xì)胞中使得終濃度分別為0、6、12和24 μM，放回培養(yǎng)箱孵育12～72 h用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3GFP-LC3斑點(diǎn)計(jì)數(shù)

細(xì)胞爬片后，經(jīng)IRN處理的細(xì)胞用PBS漂洗一遍后，4%多聚甲醛固定15min，含0.3%TritonX-100 PBS透化10 min，羊血清封閉30 min后，加入LC3抗體（1：200），4℃孵育過夜，PBS漂洗后加入FITC標(biāo)記的二抗（1∶50）室溫下避光反應(yīng)1h，PBS漂洗后用Fluor Save試劑封片，熒光顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)斑點(diǎn)情況。隨機(jī)選擇視野中至少50個(gè)細(xì)胞用于計(jì)數(shù)，計(jì)算斑點(diǎn)總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.4免疫印跡

經(jīng)不同濃度IRN處理后，冷PBS漂洗一遍，RIPA裂解細(xì)胞，收集蛋白并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按20 μg/泳道蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜并用脫脂牛奶封閉后，加入抗mTOR磷酸化抗體（1∶1000）、P70S6K（1∶1000）、LC3（1∶1000）、Beclin1（1∶1000），p62 （1∶2000）和β-actin（1∶5000）抗體于4℃孵育過夜。取出膜用TBS-T漂洗3次后，將膜和相應(yīng)2抗（1∶5000）在搖床上室溫孵育1 h，取出膜后TBS-T漂洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，用LI-COR免疫印跡成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以ImageJ軟件分析各條條帶積分吸光度值，以β-actin條帶為內(nèi)參，將目標(biāo)條帶吸光度數(shù)值除以β-actin條帶吸光度數(shù)值后得到目標(biāo)條帶的相對(duì)表達(dá)量，所有免疫印跡實(shí)驗(yàn)數(shù)值均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的均值，并表示為平均光密度值±SD值形式用于半定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均值，計(jì)量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布，則組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用ANOVA方差分析；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù) Mann-Whitney檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　IRN誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬的發(fā)生

表1　不同濃度IRN對(duì)自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響（x±s，n=3）

2　結(jié)果

2.1異鉤藤堿引起SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

LC3-Ⅱ是自噬特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平一定程度上反映細(xì)胞自噬體情況。如圖1所示，不同濃度IRN作用SH-SY5Y細(xì)胞后可以上調(diào)LC3蛋白的表達(dá)，并且有劑量依賴性，即隨著IRN濃度增加，表達(dá)水平也逐漸上調(diào)，對(duì)條帶進(jìn)行量化后，其數(shù)值在0、6、12、24 μM組中，LC3-Ⅰ的相對(duì)β-actin表達(dá)分別為（1.69±0.16）、（1.80±0.27）、（1.57±0.15）、（1.78±0.12），LC3-Ⅱ的表達(dá)分別為（0.086±0.02）、（0.39±0.14），（0.96±0.09）、（1.93±0.14）。而p62的表達(dá)水平則逐漸下調(diào)，其數(shù)值在0、6、12、24 μM組中分別為（2.28± 0.21）、（1.50±0.20）、（1.11±0.13）、（0.91±0.15）。提示IRN可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。隨后我們通過建立恒定表達(dá)GFP-LC3的細(xì)胞株，用來觀察IRN處理以后GFPLC3斑點(diǎn)的形成情況，如圖1C所示IRN作用24 h后，可以顯著誘導(dǎo)大量GFP-LC3斑點(diǎn)的形成，GFPLC3熒光斑點(diǎn)數(shù)目在對(duì)照和IRN不同濃度處理組（6、12、24 μM）中分別為2±1/細(xì)胞，4±1/細(xì)胞，8±1/細(xì)胞，和14±2/細(xì)胞，IRN各濃度組與對(duì)照組比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P＜0.05）。以上結(jié)果都證實(shí)IRN是可以引起神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y自噬發(fā)生的誘導(dǎo)物質(zhì)。

2.2異鉤藤堿對(duì)自噬體成熟的影響

為了解IRN對(duì)自噬的誘導(dǎo)機(jī)制，我們進(jìn)一步通過加入溶酶體抑制劑CQ來判斷其是否可以影響自噬溶酶體成熟，如圖2所示，通過CQ和IRN處理12 h后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行WB分析提示，CQ作用后可以顯著的提高LC3的表達(dá)，LC3-Ⅰ表達(dá)水平從對(duì)照組的（0.92±0.0011）上調(diào)到（0.68±0.02），LC3-Ⅱ從對(duì)照組中的（0.11±0.03）上調(diào)到（0.29±0.04）。在CQ加入IRN后可以進(jìn)一步提高LC3-Ⅰ（0.76±0.03）和LC3-Ⅱ（0.64±0.052）的表達(dá)，要顯著高于單用CQ組（0.68± 0.02）的水平（n=3，P＜0.05）。此外我們還分析了GFPLC3的斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRN組中為14±2/細(xì)胞，而用5mM的3MA處理24 h后，可削弱IRN對(duì)GFP-LC3斑點(diǎn)的誘導(dǎo)效應(yīng)，GFP-LC3斑點(diǎn)為3±1/細(xì)胞（n=3，P＜0.05）。在單用CQ和CQ+IRN組中，GFP-LC3為21±2/細(xì)胞，和30±3/細(xì)胞，提示CQ刺激LC3表達(dá)，和IRN合用后，效果增強(qiáng)。該進(jìn)一步證實(shí)，IRN是SH-SY5Y細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)物，并與CQ有協(xié)同促進(jìn)LC3-Ⅱ表達(dá)的作用，其誘導(dǎo)的自噬可以被3-MA阻斷。

2.3異鉤藤堿對(duì)a-Syn蛋白聚集的影響

為進(jìn)一步了解IRN對(duì)當(dāng)代聚集的影響，考察對(duì)a-Syn蛋白表達(dá)的影響。如圖3A所示，隨著IRN濃度的增加，a-Syn的表達(dá)水平逐漸下調(diào)，并呈現(xiàn)濃度依賴性，在0、6、12、24 μM組中的相對(duì)表達(dá)量為：（0.71± 0.07），（0.69±0.05），（0.53±0.04），（0.36±0.034）。隨后對(duì)我們加入CQ和3-MA，結(jié)果顯示3-MA可以上調(diào)a-Syn的表達(dá)（0.64±0.04），這也就提示，在神經(jīng)元細(xì)胞中，抑制自噬可能會(huì)抑制積聚蛋白的降解。而在3-MA+IRN組中，可以上調(diào)a-Syn表達(dá)（0.63±0.04），提示3-MA對(duì)由IRN引起的a-Syn積聚有一定的削弱作用。而在CQ處理組中，a-Syn的表達(dá)有一定程度的上調(diào)（0.42±0.04），同時(shí)加入IRN和CQ后以后對(duì)a-Syn的表達(dá)并無顯著影響（0.36±0.032，與單用CQ組比，n=3，P＞0.05）。該結(jié)果提示3-MA對(duì)a-Syn積聚的影響較大，自噬是清理a-Syn的重要途徑，IRN可以減少a-Syn的表達(dá)。

圖2　IRN聯(lián)合溶酶體穩(wěn)定劑以及自噬抑制劑后對(duì)LC3表達(dá)的影響

表2　加入自噬抑制劑后對(duì)細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)目的影響

圖3　IRN對(duì)a-Syn蛋白表達(dá)的影響

表3　IRN加入不同自噬抑制劑后對(duì)a-Syn蛋白表達(dá)水平的影響

2.4異鉤藤堿誘導(dǎo)自噬的途徑分析

為了進(jìn)一步闡明IRN作用的分子機(jī)制。我們對(duì)自噬經(jīng)典途徑mTOR進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4A所示，磷酸化mTOR以及其底物p70s6k都不受IRN的影響，而陽性藥物雷帕霉素加入后可以大幅度抑制mTOR和pP70s6k磷酸化。此外，我們還檢測(cè)在IRN處理后，其他的幾個(gè)途徑包括AKT、AMPK、MEK/ERK、JNK和ER應(yīng)激途徑，以及鈣信號(hào)途徑等，都未見有顯著改變（數(shù)據(jù)未展示）。最后我們檢測(cè)了Beclin1蛋白，該蛋白是自噬激活中的關(guān)鍵因子，上調(diào)Beclin1后可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，結(jié)果如圖4所示，IRN并不影響B(tài)eclin1蛋白的表達(dá)，但是用Beclin1特異性是siRNA干擾其表達(dá)以后可以顯著抑制由IRN誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ的表達(dá)，這一結(jié)果也提示，Beclin1蛋白在IRN誘導(dǎo)自噬中的作用也是非常關(guān)鍵的，提示IRN直接作用的蛋白可能需要Beclin1蛋白的協(xié)助形成自噬激活物后發(fā)揮作用。

圖4　IRN對(duì)mTOR磷酸化以及Beclin1表達(dá)的影響

3　討論

細(xì)胞自噬過程中，常常伴隨有LC3蛋白的表達(dá)，LC3即Light chain3，最初被認(rèn)為是微管相關(guān)蛋白1A 和1B即MAP1LC4，隨后在酵母中發(fā)現(xiàn)，和該蛋白高度同源的Atg8/Aut7/Cvt5對(duì)于自噬至關(guān)重要，在人體中LC3有3種亞型，LC3A、LC3B和LC3C。在自噬開始前以無活性的形式存在，LC3通過羧基端即C端與自噬相關(guān)的特異性基因4（Atg4）結(jié)合，剪切為L(zhǎng)C3-Ⅰ在胞漿內(nèi)表達(dá)，隨后通過泛素化系統(tǒng)與脂酰乙醇胺（PE）發(fā)生酯化反應(yīng)，得到LC3-Ⅱ（LC3-PE），這其中有Atg7和Atg3的參與。LC3-Ⅱ分子可以特異地結(jié)合在自噬膜泡的內(nèi)膜和外膜上，LC3-Ⅱ的含量與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)，從而可以用于評(píng)估自噬活性［7］。因此，其常作為研究細(xì)胞自噬的標(biāo)志分子。本研究結(jié)果顯示，不同濃度IRN處理SH-SY5Y細(xì)胞24h可濃度依賴性地上調(diào)LC3-Ⅱ表達(dá)，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高，IRN 6～24 μmol·L-1處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，GFP-LC3熒光斑點(diǎn)標(biāo)記的自噬體增多，提示自噬體大量形成。這些結(jié)果都證明，IRN可能通過激活自噬相關(guān)蛋白LC3導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生自噬。目前，有關(guān)自噬在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道不一［8，9］，在亨廷頓病研究中發(fā)現(xiàn)，依賴神經(jīng)元細(xì)胞自噬途徑可加速突變亨廷頓蛋白清除，減少蓄積，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生可減緩神經(jīng)的退行性變［10，11］。在阿爾茨海默病中的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞中的自噬體富含Aβ和APP羧基末端偏殿，以及早老素依賴性的γ-分泌酶，抑制神經(jīng)元自噬將有助于減少Aβ40和Aβ42額分泌，而誘導(dǎo)自噬則可以促進(jìn)前述2種蛋白的分泌。但是從另一種角度，自噬也是清除Aβ的一種途徑，較多的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，誘導(dǎo)自噬可以減少Aβ的聚集。因此自噬在AD的發(fā)病機(jī)制中的作用存在爭(zhēng)議［12，13］。在海藻酸鈉誘導(dǎo)大鼠紋狀體神經(jīng)元興奮性損傷研究中，自噬的激活可促進(jìn)神經(jīng)元死亡，并可被自噬抑制劑所削弱。以上研究提示，細(xì)胞自噬的發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中既有保護(hù)作用又可能有損傷作用，和具體的疾病和神經(jīng)元有關(guān)。有研究顯示，IRN可以保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗由β-淀粉樣蛋白引起的細(xì)胞凋亡［14］，在多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示，IRN可以改善由β-淀粉樣蛋白引起的大鼠認(rèn)知損傷，主要與抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和tau蛋白形成有關(guān)［15］，IRN可以改善D-半乳糖引起的小鼠學(xué)習(xí)和記憶損傷［16］，這些研究都從不同角度證實(shí)了IRN在神經(jīng)元保護(hù)中的作用和價(jià)值，結(jié)合本研究得到的結(jié)果，我們認(rèn)為IRN在神經(jīng)元退行性疾病中可能主要以保護(hù)作用為主。

多巴胺能神經(jīng)元是PD患者大腦中受影響主要細(xì)胞，a-Syn在期中樞神經(jīng)細(xì)胞中的過表達(dá)可以導(dǎo)致多種生物體多巴胺能神經(jīng)元的變性。a-Syn降解主要通過蛋白酶體、自噬以及伴侶分子介導(dǎo)的自噬即CMA等途徑，但是僅有2個(gè)自噬途徑可以降解a-Syn。具體說，已經(jīng)有報(bào)道，a-Syn可以抑制cma并其只有巨自噬才能降解該蛋白。自噬也被認(rèn)為可用于對(duì)抗突觸核蛋白病的治療策略，本研究中結(jié)果提示IRN可以顯著削弱a-Syn的表達(dá)，后續(xù)研究將進(jìn)一步考察IRN 對(duì)a-Syn突變體以及a-Syn/Synphilin-1聚集體的影響，這些結(jié)果在既往針對(duì)雷帕霉素、海藻糖以及17-AAG中的研究中未見報(bào)道。Beclin1是酵母自噬相關(guān)的特異性基因6也就是Atg6在人體中的同源體，主要可表達(dá)在高爾基體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞漿內(nèi)［17］，參與調(diào)控自噬前體生成和自噬體的形成。因此，Beclin1表達(dá)增強(qiáng)也可作為評(píng)價(jià)自噬水平升高的重要指標(biāo)。盡管IRN作用后不影響B(tài)eclin1表達(dá)，但是siRNA干擾Beclin1后可以顯著削弱IRN誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ上調(diào)，提示Beclin1參與IRN誘導(dǎo)的自噬，后者可能會(huì)影響到自噬體其他相關(guān)蛋白表達(dá)。本研究組將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步明確IRN對(duì)Beclin1相關(guān)蛋白的影響。以期進(jìn)一步證實(shí)自噬在IRN誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬中的作用及與Beclin1的關(guān)系。

細(xì)胞自噬性死亡的發(fā)生受多種因子的調(diào)控，主要可以分為mTOR依賴性通路和mTOR非依賴性通路［18］，mTOR作為一個(gè)絲蘇氨酸蛋白激酶，能夠感知細(xì)胞內(nèi)ATP、生長(zhǎng)因子、胰島素的水平，進(jìn)而也就是感受細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量的變化，參與組成TORC1和TORC2，并可以受上游多種不同信號(hào)通路的影響，比如經(jīng)典的PI3K、MAPK等通路，影響自噬的發(fā)生［19］。mTOR的活化和抑制主要受到TSC1/TSC2的控制。而mTOR非依賴性通路則主要包括RAS-MAPK、Ca-AMPK、p53、PTEN以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［20］。同時(shí)我們的研究也提示，IRN通過mTOR非依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并排除了其他幾種mTOR非依賴性通路的可能，但是未對(duì)p53以及PTEN等通路進(jìn)行檢測(cè)，后續(xù)研究有必要進(jìn)一步分析其作用的具體蛋白，IRN通過mTOR非依賴性通路發(fā)揮作用，也在一定程度上消除了未來臨床應(yīng)用中與mTOR途徑相關(guān)的副作用和并發(fā)癥發(fā)生的可能性。

本研究結(jié)果表明，IRN可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，溶酶體穩(wěn)定后可以促進(jìn)IRN誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)，自噬抑制劑3-MA作用后則削弱其表達(dá)，分子途徑分析認(rèn)為，IRN誘導(dǎo)的自噬為mTOR非依賴型，對(duì)Beclin1蛋白的表達(dá)無影響，可能通過活化與Beclin1相關(guān)蛋白，與Beclin1結(jié)合后活化自噬有關(guān)。綜上所述，IRN作為一種可以通過血腦屏障的傳統(tǒng)中藥鉤藤的活性組分，不僅能夠減少異常蛋白的積聚，而且有潛在的保護(hù)作用，IRN有進(jìn)一步研究的價(jià)值，并有望將結(jié)果應(yīng)用于臨床。

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Occurrence of autophagy of SH-SY5Y cells induced by isorhynchophylline via independent pathway of mTOR

XU Yan1YAN Wang2CAI Yawei1WANG Jiye3
1.Department of Geriatrics，Ningbo Second Hospital，Ningbo 315010，China；2.Department of Neurology，Ningbo Second Hospital，Ningbo315010，China；3.Zhejiang Police College，Hangzhou 310053，China

R742.5

A

1673-9701（2016）17-0028-07

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃基金項(xiàng)目支持（2014 KYA198）
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（2016-03-31）