王　政，李　哲，李　靖，楊春秀，張　健，沈　素，余俊先，王汝龍（.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院藥學部，北京 00050；.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心，北京 00050）

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HPLC-MS/MS測定唾液中華法林濃度及其與血藥濃度關系的探討

王政1，李哲1，李靖2，楊春秀1，張健2，沈素1，余俊先1，王汝龍1（1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院藥學部，
北京 100050；2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心，北京 100050）

目的：建立唾液中華法林濃度的HPLC-MS/MS分析方法，并探討其與血藥濃度的關系。方法：采用HPLC法，色譜柱為SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）/0.1％甲酸水溶液（B），流速0.4 mL·min-1，梯度洗脫；質譜采用ESI正離子模式。待測樣本為服用華法林患者的唾液及血漿（均于服藥后12 h采集）。結果：目標化合物華法林與內標BA-TPQ的離子質荷比（m/z）分別為309.1→163和278→91.1，二者洗脫分離完全，保留時間分別為1.828 min和1.566 min。華法林的提取回收率穩(wěn)定，日內、日間精密度RSD ＜ 15％。待測樣本的唾液華法林濃度為5.44 ng·mL-1，5.70 ng·mL-1和8.79 ng·mL-1，與其對應的血漿樣品濃度為626.04 ng·mL-1、735.51 ng·mL-1、1 206.79 ng·mL-1。結論：本文建立的HPLC-MS/MS檢測方法，可用于臨床華法林的藥物濃度監(jiān)測，探索性的結果表明華法林的唾液濃度與血漿濃度的消除成平行關系，可考慮作為替代監(jiān)測指標之一。

華法林；HPLC-MS/MS；唾液；血漿；血藥濃度

華法林是目前應用最廣泛的香豆素類口服抗凝藥，通過抑制肝臟中依賴維生素K的凝血因子來發(fā)揮作用，用于預防和治療深靜脈血栓、肺栓塞、心臟瓣膜置換術及心房顫動導致的血栓形成，降低心肌梗死復發(fā)及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危險性［1-2］。華法林的治療窗窄、個體差異大，影響因素多，遺傳變異和種族差異是劑量個體化的最主要原因［3-4］。華法林抗凝療效與患者術后出血或栓塞并發(fā)癥、遠期生存質量及生存率密切相關［5］，因此服藥患者的抗凝監(jiān)測十分重要，監(jiān)測不當可導致出血或栓塞等并發(fā)癥， 嚴重者可危及患者生命［6］。

國際標準化比值（INR）法因校正了試劑敏感性的差異，使測定結果能相對較準確地反映抗凝強度，在臨床上廣泛使用。尋求一種無創(chuàng)、快捷、簡便、靈敏、準確的分析方法和簡便的樣品采集裝置已日漸引起研究者的關注，唾液為非創(chuàng)傷性采集的體液樣本，采集方便，且可避免因抽血帶來的身體不適、暈血及感染等［7］。為此我們參考已有的關于華法林血漿藥物濃度的測定方法［8］，嘗試建立唾液中華法林濃度測定方法學，以期為其臨床藥物監(jiān)測提供參考。

1　材料與方法

1.1藥品和試劑

華法林（分析純，純度97.2％，批號45706-250MG-R， Sigma-Aldrich公司）；內標物：BA-TPQ（純度98％）［8］；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，乙酸乙酯為分析純，其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器和分析參數(shù)

1.2.1主要儀器 HPLC-MS/MS系統(tǒng)，包括1200液相色譜（二元泵、脫氣機、自動進樣器、柱溫箱等）和6460三重四級桿質譜（美國Agilent公司）；BS 124S分析天平（德國Sartorius公司）；MS-3渦旋器（德國IKA公司）；Sigma 3-18K低溫離心機（德國Sartorius公司）。

1.2.2HPLC-MS/MS參數(shù)設置 色譜柱為SB-C18柱（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）；流動相：乙腈（A）-0.1％甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0 ～ 1 min 50％ A，1 ～ 2 min 90％ A，2 ～ 3 min 50％ A；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃。離子源為電噴霧離子源ESI，正離子模式；毛細管電壓5 kV；干燥氣流速8 L·min-1；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力30 psi；碎裂電壓50 V，詳見表1。選擇的檢測離子質荷比（m/z）：華法林：309.1→163；BA-TPQ：278→91.1。

表1　華法林和內標的HPLC-MS/MS參數(shù)Tab 1　HPLC-MS/MS parameters of warfarin and IS

1.3方法學考察

1.3.1工作液、標準曲線及質控樣品的配制 工作液：精密稱取華法林10 mg和內標BA-TPQ 5 mg，以甲醇為溶劑配制成1 mg·mL-1的儲備液及1 μg·mL-1的內標液。以甲醇為溶媒，將儲備液分別稀釋成50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、250 ng·mL-1、500 ng·mL-1、2.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、30 μg·mL-1的工作液。取工作液5 μL，分別用空白唾液和空白血漿稀釋配制標準曲線，唾液L1-L8為1、2、5、10、50、100、200、600 ng·mL-1，低、中、高三個質控樣品的濃度為2、40、500 ng·mL-1，血漿的L1-L8為10、20、50、100、200、500、1000、3000 ng·mL-1。

1.3.2樣品的預處理 取含藥唾液500 μL，加入5 μL內標液以及500 μL乙酸乙酯，渦旋60 s使樣品充分混勻，低溫離心機在4℃的條件下高速離心20 min （18 000 g），上層有機相用氮氣吹干，用100 μL流動相復溶，取2 μL進樣HPLC-MS/MS分析。取含藥血漿50 μL，加入5 μL內標液以及500 μL乙酸乙酯，其余步驟同上，氮氣吹干后以100 μL流動相復溶，取2 μL定量分析。

1.3.3回收率、準確度、精密度和基質效應 取濃度為2、40、500 ng·mL-1的質控樣品，每個濃度平行處理3份，預處理方法同“1.3.2”項下操作，考察提取回收率。每個濃度平行處理5份，考察日內和日間精密度。用流動相配制低、中、高3個濃度樣品，加入內標，測得響應值A；在空白唾液提取后加入相同質控和內標，測響應值B，基質效應ME％ = 響應值B/響應值A×100％。

1.3.4穩(wěn)定性考察 三個濃度的質控樣品按“1.3.2”項下方法預處理，考察進樣器中放置24 h的穩(wěn)定性，以及樣品經3次凍融循環(huán)于室溫放置24 h和低溫（- 20 ℃）儲存2周的穩(wěn)定性。

1.4受試者樣品檢測

臨床試驗經北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準。納入3例冠心病患者，2男1女，年齡75 ～ 81歲，華法林服藥方法均為3 mg，qd。服藥后12 h采取唾液2.0 mL，同時取靜脈血2.0 mL置于EDTA離心管中，3000 r·min-1，離心10 min，分離血漿備用。唾液和血漿樣品按“1.3.2”項下方法預處理，分別測定唾液和血漿中華法林的濃度。

2　結果

2.1方法學專屬性

在上述條件下進行檢測，華法林和BA-TPQ的保留時間分別為1.828 min和1.566 min，空白唾液和血液中內源性物質無干擾，具有較好的專屬性。詳見圖1。

2.2線性范圍、回收率和基質效應

唾液中華法林濃度在1 ～ 600 ng·mL-1范圍內線性關系良好，線性方程為y = 15.713 1 x + 0.001 9（r = 0.999 7）?？瞻籽獫{中華法林濃度在10 ～ 3000 ng·mL-1范圍內線性關系良好，線性方程為y = 0.876 x + 0.017 8 （r = 0.994 2）。相對標準偏差RSD可評估回收率及基質效應。結果表明華法林在唾液中的回收率穩(wěn)定在83.19％ ～ 102.29％，RSD在±15％以內?；|效應在83.41％ ～ 102.71％，RSD在±15％以內，對MS信號不產生干擾。

圖1　HPLC-MS/MS色譜圖A - 空白唾液，B - 空白唾液+華法林（200 ng·mL-1），C - 空白唾液+華法林（200 ng·mL-1） +內標物BA-TPQ（ 1 μg·mL-1），D - 受試者唾液樣品；1 - 華法林，2 - 內標（BA-TPQ）Fig 1　Chromatograms of HPLC-MS/MS A - blank saliva， B - blank saliva + warfarin （200 ng·mL-1）， C - blank saliva + warfarin （200 ng·mL-1） + BA-TPQ （1 μg·mL-1）， D - saliva sample of patient； 1 - warfarin， 2 - internal standard（ BA-TPQ）

2.3準確度和精密度考察

對高中低三種濃度的質控樣本在連續(xù)3 d內進行準確度和精密度的驗證（n = 5，3，3）。RSD可用于評估精密度，準確度是實際濃度平均值與理論濃度的比值，準確度和精密度需要保持在±15％，詳見表2。

表2　精密度、回收率和基質效應Tab 2　The precision， recovery and matrix effect

2.4穩(wěn)定性

反復凍融穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性實驗結果表明，華法林在反復凍融的條件下以及在進樣器中放置24 h穩(wěn)定，詳見表3。

2.5受試者唾液及血液中華法林濃度測定

收集3例長期服用華法林患者（編號Sample A、 Sample B、Sample C）唾液及血液，按“1.3.2”項下方法處理樣品并檢測濃度。結果如下，3例患者唾液中華法林濃度分別為5.44、5.70、8.79 ng·mL-1，與其對應的血液中華法林濃度分別為626.04、735.51、1 206.79 ng·mL-1。將唾液中華法林濃度與其血藥濃度進行對比，結果詳見圖2。

表3　穩(wěn)定性實驗結果Tab 3　The results of stability tests

圖2　受試者唾液和血漿中華法林的濃度分布Fig 2　Distribution of warfarin concentration in patients' saliva and plasma

3　討論

3.1INR監(jiān)測的特點

華法林臨床應用特點是治療窗窄、不良反應嚴重、個體差異大，因此服藥患者的抗凝監(jiān)測十分重要。許多服用華法林的患者年齡較大，更有腦梗后偏癱臥床者，定期到醫(yī)院抽血監(jiān)測INR及血藥濃度對患者而言較為麻煩。然而，未按指南推薦時間測定INR有可能導致抗凝強度不足或發(fā)生出血等不良反應［9］。因此，本課題組利用唾液這個取材簡便且又無創(chuàng)的體液，借助HPLC-MS/MS等多種大型儀器建立新的方法學，以期為治療藥物監(jiān)測提供新思路。

3.2唾液中華法林濃度測定的可行性

本研究結果顯示，唾液中華法林在1 ～ 600 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好，r = 0.999 7，且日間精密度、日內精密度及凍融穩(wěn)定性均符合要求，故本實驗方法學準確、可靠、穩(wěn)定。我們測定所收集的三個樣本，將華法林在患者唾液中的濃度和血漿中的濃度進行對比，二者具有相關性，與預測結果相符合。即血漿中華法林濃度較高者其唾液中含藥量也較高，這為日后建立成熟的唾液法監(jiān)測華法林濃度提供了理論基礎。

本次試驗在方法學設計上主要有以下幾點優(yōu)勢：1）采用乙酸乙酯液-液萃取法除蛋白，與蛋白沉淀法相比更為徹底［9］，使基質對測試的影響更小；2）采用梯度洗脫可保證在前1分鐘內洗脫出大量生物樣本中的水溶性雜質，又可在盡可能短的時間內（4 min）完成全部洗脫，節(jié)省試驗時間；3）質譜條件調試合理，既有較高分離度，又滿足了唾液中微量華法林的測定要求，定量下限（LLOQ）可達到1 ng·mL-1，并可保證其準確度，為此次試驗提供了良好的靈敏性。

3.3唾液中華法林濃度測定的局限性

唾液中藥物檢測受到采集技術與方法、藥物特性、給藥途徑、個體差異（年齡、機體生理疾病、情緒狀態(tài)）等因素的影響較大［10-12］，因此仍需逐步建立唾液采集標準方法和檢測標準。在未來的治療藥物監(jiān)測中，唾液所具有的采集方便、操作簡單的突出優(yōu)勢必將使其受到更多的重視，檢測技術日臻得到完善，最終更好地為臨床服務。

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Quantitative determination of warfarin in human saliva and plasma by HPLC-MS/MS and the analysis of their correlation

WANG Zheng1， LI Zhe1， LI Jing2， YANG Chun-xiu1， ZHANG Jian2， SHEN Su1， YU Jun-xian1， WANG Ru-long1
（1. Department of Pharmacy， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China； 2. Medical and Health Center， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China）

Objective： To determine the concentration of warfarin in human saliva and plasma by HPLC-MS/MS， and the correlation between saliva and plasma warfarin concentration was discussed. Methods： The separation was performed on a SB-C18column with an gradient mobile phase consisting of acetonitrile （A） / 0.1％ formic acid aqueous solution （B） at the fow rate of 0.4 mL·min-1. Detection was carried out on a mass spectrometer by positive electrospray ionization （ESI） in multiple reaction monitoring （MRM） mode. All samples were collected 12 h after warfarin therapy. Results： Warfarin and the internal standard （IS） were detected at m/z 309.1→163 and 278→91.1， respectively. Two compounds were eluted completely and their retention time were 1.828 min and 1.566 min， respectively. The intra-day and inter-day precision relative standard deviations （RSD） were less than 15％. The warfarin concentrations in saliva samples were 5.44 ng·mL-1， 5.70 ng·mL-1and 8.79 ng·mL-1， respectively. Meanwhile， the warfarin concentration in plasma were 626.04 ng·mL-1， 735.51 ng·mL-1and 1 206.79 ng·mL-1. Conclusion： The HPLC-MS/MS method can be applied to the concentration monitoring about warfarin. There is a correlation between warfarin concentration in saliva and plasma， and the warfarin concentration in saliva can be potentially considered as monitoring surrogate marker.

Warfarin； HPLC-MS/MS； Saliva； Plasma； Blood drug concentration

R917

A

1672 - 8157（2016）03 - 0144 - 04

余俊先，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學工作。E-mail：junxianyu@ccmu.edu.cn

王政，女，在讀碩士研究生，研究方向：臨床藥學。E-mail：zhengwangccmu@hotmail.com

（2015-11-15

2016-02-01）