駱瑜　熊瑋　楊純玉　梁旭

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miRNA-146a在頸動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿的表達(dá)及意義

駱瑜熊瑋楊純玉梁旭

目的研究頸動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中小分子RNA-146a(miR-146a)與斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。 方法選擇可能存在頸動(dòng)脈硬化的患者,根據(jù)頸動(dòng)脈超聲檢測(cè)結(jié)果分為正常組、穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組,常規(guī)檢測(cè)血壓、體質(zhì)量指數(shù)、肝腎功能、血糖、血脂、尿酸、超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP),采用ELISA法檢測(cè)血漿中IL-1水平,采用real time PCR檢測(cè)血漿中的miRNA-146a的表達(dá)水平。結(jié)果3組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、血糖、血脂、尿酸、肝腎功能差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與正常組比較,不穩(wěn)定斑塊組患者的血清hsCRP及血漿IL-1均明顯升高(P<0.05);穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組患者血漿中的miR-146a水平均明顯升高(P<0.05),不穩(wěn)定斑塊組升高更加顯著(P<0.01)。miR-146a與hsCRP呈弱正相關(guān),與IL-1呈強(qiáng)正相關(guān)。結(jié)論miR-146a可能參與了頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程。

小分子RNA-146a; 頸動(dòng)脈; 動(dòng)脈粥樣硬化; 不穩(wěn)定斑塊

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是臨床上老年人常見(jiàn)的心血管疾病,不穩(wěn)定斑塊破裂導(dǎo)致的腦卒中和急性心肌梗死已成為我國(guó)居民死亡的首要病因[1]。microRNA (miR)是一類長(zhǎng)度為21～29個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA,它們能夠識(shí)別特定的目標(biāo)mRNA,在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因表達(dá),編碼超過(guò)30%的基因,與人類的生命活動(dòng)和疾病的發(fā)生關(guān)系十分密切[2]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),miR-146a可以通過(guò)正反饋調(diào)控NF-κBp65的方式促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的增殖,可能參與了AS的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。本文通過(guò)研究AS患者外周血液中miR-146a的水平變化,探討miR-146a與動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象所有病例均來(lái)自于自2012年7月至2014年12月在我院就診的門診和住院患者。所有病例均為無(wú)血緣關(guān)系的華南地區(qū)漢族人群,經(jīng)相關(guān)檢查排除急慢性感染、手術(shù)、創(chuàng)傷、肝腎疾病、惡性腫瘤、類風(fēng)濕性疾病、繼發(fā)性高血壓、心力衰竭、心瓣膜病以及存在酗酒、服用避孕藥的患者。

1.2研究方法

1.2.1一般項(xiàng)目檢測(cè): 所有患者常規(guī)檢查血壓,連續(xù)測(cè)量3次,取平均值作為該患者的血壓。測(cè)量身高(m)、體質(zhì)量(kg),計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。所有受試者空腹8 h以上，于清晨取臥位肘靜脈血4 ml,-80 ℃保存待測(cè)。所有患者常規(guī)測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血肌酐、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹血糖(FBG)、血尿酸(UA)、超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)。

1.2.2頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲檢查:采用飛利浦公司IE33型彩色多普勒超聲顯像儀,由專人進(jìn)行檢查,探頭頻率7.5～10.0 MHz,常規(guī)檢查頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。測(cè)量血管內(nèi)徑、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT),觀察斑塊的部位、大小、形態(tài)、數(shù)量、回聲特點(diǎn)、血流信號(hào)、有無(wú)充盈缺損等。將IMT>1.0 mm定義為頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚;IMT>1.3 mm并明顯突出內(nèi)膜為頸動(dòng)脈斑塊形成。硬斑為斑塊呈強(qiáng)回聲;軟斑為斑塊呈中等或弱回聲,形態(tài)規(guī)則或不規(guī)則,內(nèi)膜向腔內(nèi)凸起,內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻或不均勻;混合斑形態(tài)介于硬斑及軟班之間。硬斑為穩(wěn)定性斑塊,軟斑和混合斑為不穩(wěn)定性斑塊。所有患者均連續(xù)測(cè)量每側(cè)頸動(dòng)脈3次,取平均值計(jì)算IMT。

1.2.3血漿白細(xì)胞介素-1(IL-1)測(cè)定:經(jīng)肘靜脈采血3 ml,按照試劑盒說(shuō)明用ELISA法測(cè)定血漿IL-1濃度。

1.2.4檢測(cè)血漿miR-146a:按照RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)說(shuō)明書提取RNA,紫外分光光度儀(260/280)檢測(cè)RNA濃度(1.8～2.0者采用),聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定總RNA的純度。

2　結(jié)果

2.1一般情況在93例患者中,男65例,女28例,年齡47～87歲,平均(68.2±9.7)歲。3組患者的年齡、血壓、BMI、ALT、血肌酐、血脂、FBG、UA差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2hsCRP和IL-1水平的比較與正常組相比,不穩(wěn)定斑塊組患者的hsCRP明顯升高(P<0.05)。與正常組相比,穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組患者的血IL-1水平明顯上升(P<0.05),不穩(wěn)定斑塊組患者的IL-1升高更加顯著(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1　3組患者的臨床資料±s)

表2　3組患者外周血的hsCRP和IL-1水平比較

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3miR-146a表達(dá)與正常組患者相比,穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組患者血漿miR-146a水平均上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),不穩(wěn)定斑塊組患者血漿的miR-146a水平升高更顯著。見(jiàn)表3。采用相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),不穩(wěn)定斑塊組患者的血漿miR-146a水平與血清hsCRP的相關(guān)系數(shù)r=0.45,呈弱正相關(guān);血漿miR-146a與血漿IL-1的相關(guān)系數(shù)r=0.87。

表3　3組患者的血漿miR-146a mRNA相對(duì)水平

注:與正常組相比,*P<0.05,**P<0.01

3　討論

小分子RNA作為一個(gè)廣泛分布的重要的基因調(diào)節(jié)因子,在機(jī)體的正常生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病和死亡等生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。近年來(lái),對(duì)miRNA表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其調(diào)控相關(guān)疾病如惡性腫瘤、病毒感染、炎癥和免疫性疾病、內(nèi)分泌及代謝性疾病以及作為基因靶向藥物的研究表明miRNA不僅參與了疾病的發(fā)生發(fā)展,同時(shí)也可以作為疾病的生物學(xué)診斷標(biāo)志用于疾病的診斷,作為基因藥物用于疾病的治療[6-7]。

miR-146是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的小RNA,其家族包括miR-146a和miR-146b 2個(gè)成員,它們分別位于5號(hào)和10號(hào)染色體上,2者的成熟序列的3′端存在2個(gè)堿基的差異,而5′端堿基的關(guān)鍵序列相同[8]。研究發(fā)現(xiàn),用脂多糖刺激單核細(xì)胞,可以誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)增加,用TNF-α和IL-1β也能夠通過(guò)NF-κB依賴的途徑促進(jìn)miR-146a的表達(dá)。miR-146a通過(guò)下調(diào)TNF受體相關(guān)因子6和IL-1受體相關(guān)激酶1水平,調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)[9-10]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、膿毒血癥等疾病的研究中也證實(shí)了miRNA-146a在疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用,可以作為某些疾病的生物學(xué)標(biāo)志[11-12]。Min等[13]發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-146a的水平顯著升高,并能上調(diào)Th1細(xì)胞的功能,給予miR-146a可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和NF-κBp65的合成,表明miRNA-146a可能與冠心病患者的免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),在VSMC增殖過(guò)程中,miR-146a水平顯著上調(diào)。在用小分子干擾RNA沉默miR-146a后VSMC的生物學(xué)行為發(fā)生顯著改變,表現(xiàn)為增殖和遷移能力下降,凋亡增加;同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默miR-146a后,NF-κBp65、增殖細(xì)胞核抗原蛋白水平亦明顯下降,Bax蛋白水平明顯增加。我們的研究表明,miR-146a通過(guò)上調(diào)NF-κBp65、增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)促進(jìn)VSMC的增殖和遷移,通過(guò)下調(diào)Bax表達(dá)抑制VSMC的凋亡,提示miR-146a可能以正反饋調(diào)控NF-κBp65的方式促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展,可能是AS和易損斑塊的血清標(biāo)志物之一[3-5]。

本文研究了不同類型頸動(dòng)脈斑塊患者的血液miR-146a水平的變化。結(jié)果表明,與正常患者相比,頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的循環(huán)miR-146a水平上升(P<0.05),而且隨著頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展,由穩(wěn)定斑塊向不穩(wěn)定斑塊發(fā)展后,不穩(wěn)定斑塊患者的血液miR-146a水平上升更加明顯(P<0.01),提示miR-146a可能參與了頸動(dòng)脈粥樣硬化的病理發(fā)展過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn),隨著miR-146a水平的升高,不穩(wěn)定斑塊患者的hsCRP及IL-1水平也升高,miR-146a與hsCRP及IL-1均存在正相關(guān),表明miR-146a可能是頸動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥生物學(xué)標(biāo)志之一,但miR-146a在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證和探討。

[1]王其新.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病介入治療回顧與展望[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué),2015,29(1):3-5.

[2]Esteller M. Non-coding RNAs in human disease[J]. Nat Rev Genet,2011,12(12):861-874.

[3]Dong SH, Xiong W, Yuan J, et al. MiRNA-146a regulates the maturation and differentiation of vascular smooth muscle cells by targeting NF-κB expression[J]. Mol Med Rep,2013,8(2):407-412.

[4]熊瑋,董少紅,袁建輝,等.MiRNA-146a通過(guò)NF-κB依賴的途徑促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(2): 270-273.

[5]熊瑋,董少紅,袁建輝,等.微小RNA-146a影響血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(20):3715-3719.

[6]van Rooij E, Olson EN.MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles[J].Nat Rev Drug Discov,2012，11(11):860-872.

[7]Vickers KC, Rye KA, Tabet F.MicroRNAs in the onset and development of cardiovascular disease[J].Clin Sci (Lond),2014，126(3):183-194.

[8]Li L, Chen XP, Li YJ.MicroRNA-146a and human disease[J].Scand J Immunol,2010,71(4):227-231.

[9]Bhaumik D, Scott GK, Schokrpur S, et al. Expression of microRNA-146 suppresses NF-kappaB activity with reduction of metastatic potential in breast cancer cells[J].Oncogene,2008, 27(42): 5643-5647.

[10]Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, et al. NF-κB dependent induction of microRNA miR-146a, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103 (33):12481-12486.

[11]Kaleb MP, Minoru S, Annie LC,et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients[J]. Arthritis Research Therapy,2008,10(4):R101.

[12]Pacifico F, Crescenzi E, Mellone S,et al. Nuclear factor-kappaB contributes to anaplastic thyroid carcinomas through up-regulation of miR-146a[J]. J Clin Endocrinol Metab,2010,95(3):1421-1430.

[13]Guo M, Mao X, Ji Q, et al. MiR-146a in PBMCs modulates Th1 function in patients with acute coronary syndrome[J]. Immunology and Cell Biology,2010,88(5): 555-564.

Expression and significance of plasma miRNA-146a in the patients with carotid atherosclerosis

LUOYu,YANGChun-yu,LIANGXu.

DepartmentofGerontology;XIONGWei.DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospitalofJinanMedicalCollege(ShenzhenPeople’sHospital),Shenzhen518020,China

ObjectiveTo investigate the association between miRNA-146a and carotid atherosclerosis.Methods106 cases in our hospital were divided into normal group, stable plaque group and unstable plaque group according to carotid ultrasonography. The levels of blood pressure, body mass index(BMI), liver function(ALT), renal function(serum creatinine), fasting blood glucose, blood fat, uric acid and high sensitive C-reactive protein (hsCRP) were measured. ELISA was used to measure the plasma level of interleukin-1(IL-1).The plasma level of miRNA-146a was detected by real time polymerase chain reaction technology.ResultsThere were no significant differences in age, blood pressure, BMI, ALT, serum creatinine, blood glucose, blood fat between three groups(P>0.05). Compared with normal group, the levels of hsCRP and IL-1 in unstable plaque group significantly increased (P<0.05). The plasma level of miRNA-146a in the patients with plaque was significantly increased, compared with normal group (P<0.05), especially in the patients with unstable plaque (P<0.01). There was mild positive association between plasma miRNA-146a and serum hsCRP, and there was strong positive association between plasma miRNA-146a and plasma IL-1.ConclusionsmiRNA-146a may be related with the pathological progress of carotid atherosclerosis.

microRNA-146a;carotid; atherosclerosis;unstable plaque

深圳市科技資助課題(201302004)

518020廣東省深圳市，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(深圳市人民醫(yī)院)老年病科(駱瑜，楊純玉，梁旭)；心內(nèi)科(熊瑋)

梁旭，Email:Liangxu916@hotmail.com

R 543.4

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.04.015

2015-05-12)