丁文艷　鐘天鷹　高玲娟

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高危型HPV E2在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

丁文艷鐘天鷹高玲娟

宮頸癌是世界范圍內(nèi)威脅女性健康的常見生殖道惡性腫瘤,人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌及其相關(guān)病變的首要因素[1],組織學(xué)確診為侵襲性宮頸癌(ICC)的病例中,99.7% HPV DNA為陽性,其中HPV 16占51%,HPV 18占12.6%～25.7%[2]。研究揭示,高危型HPV E2作為一種反式調(diào)控因子,控制E6和E7基因的持續(xù)表達(dá)進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的增殖[3],為進(jìn)一步明確高危型HPV E2與宮頸癌的關(guān)系,我們?cè)诖颂接懜呶Ｐ虷PV E2在宮頸癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義。

1　材料與方法

1.1材料收集2009年3月至2013年2月間,于南京市婦幼保健院行宮頸癌手術(shù)患者的腫瘤組織30例,同時(shí)收集相應(yīng)的癌旁正常宮頸組織(距腫瘤組織>5 cm)做為對(duì)照,置于液氮凍存?zhèn)溆?。按年齡分為≥60歲的老年組與<60歲的非老年組。老年組12例,平均年齡(65.24±4.24)歲,非老年組18例,平均年齡(45.24 ± 3.87)歲。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞株SiHa由杭州赫貝生物公司提供。細(xì)胞接種于完全營養(yǎng)液中,每50 ml培養(yǎng)瓶中加入6 ml完全營養(yǎng)液(15%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml鏈霉素,以及非必需氨基酸10 ml/L,pH 7.2),置37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR，RT-PCR)PCR反應(yīng)體系構(gòu)成為20 μl，含0.1 μmol/L熒光標(biāo)記探針、1×TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)、引物各0.2 μmol/L及DNA模板100～200 ng。ABI Prime 7300定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為：50 ℃/2 min，95 ℃/3 min，95 ℃/15 s，60 ℃/2 min，40個(gè)循環(huán)測(cè)試，單點(diǎn)熒光在60 ℃進(jìn)行檢測(cè)。選擇FAM熒光檢測(cè)模式，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用以下公式進(jìn)行計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：2-△△CT=2-(CT.HPV E2- CT.actin)Time x + (CT. HPV E2- CT.actin)Time 0。

1.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定 轉(zhuǎn)染前24 h，宮頸癌細(xì)胞傳代至9孔培養(yǎng)板，每孔2.0 × 105個(gè)細(xì)胞。將宮頸癌細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染高危型HPV E2載體，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體，空白組不經(jīng)任何處理。用100 μl Opti-MEM稀釋1.6 μg質(zhì)粒DNA，輕輕吹吸4次，室溫放置10 min。用100 μl Opti-MEM稀釋4.0 μl Lipofectamine，輕輕吹吸4次，室溫放置20 min。將質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫下放置30 min。將培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞(80%)棄培養(yǎng)液，不完全營養(yǎng)液洗滌細(xì)胞5次；將混合液加入細(xì)胞上；于37 ℃ 5% CO2孵箱轉(zhuǎn)染6 h，換液，加入完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；轉(zhuǎn)染效率以熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)進(jìn)行判斷，通過GFP的表達(dá)確定收獲細(xì)胞的最佳時(shí)段。

1.5宮頸癌組織的胞漿蛋白提取Western blot 提取宮頸癌組織的胞漿蛋白,取100 μg總蛋白上樣,采用等體積的1×loading buffer進(jìn)行電泳,初始電壓為45 V,電壓達(dá)到65 V后,改用穩(wěn)壓電泳。當(dāng)目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm以上時(shí),結(jié)束電泳實(shí)驗(yàn)。濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將膜置于封閉液中,室溫封閉2 h,放進(jìn)含小鼠抗人高危型HPV E2單克隆抗體釋液中,搖床上37 ℃孵育2 h,TBST洗滌15 min×3次。將膜放進(jìn)含抗小鼠IgG二抗稀釋液中,搖床上室溫孵育1 h,TBST滌15 min×3次。暗室中剪適合大小的膠片壓在膜上15 s,將膠片放入顯影液中反應(yīng)1 min,取出滴干液體放入水中沖洗,放入定影液中定影5 s,自來水沖洗。

1.6MTT法(methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性收集對(duì)數(shù)期宮頸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至6 ×105/ml，將細(xì)胞懸液接種于96孔板，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20μl MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h。加入1 M的DMSO 150 μl，低速震蕩15 min，充分溶解結(jié)晶物。OD 490 nm波長，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取吸光度(A)值。以公式：細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞凋亡率 胰酶消化對(duì)數(shù)期生長的宮頸癌細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，調(diào)整其濃度至5 ×106/ml。500～1000 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷，4 ℃無菌的PBS充分洗滌細(xì)胞3次，用200 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl 的PI溶液，室溫下，避光孵育30 min。將試管置于冰上，與Annexin V-FITC/PI孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞凋亡情況。

2　結(jié)果

2.1高危型HPV E2在宮頸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)水平RT-PCR結(jié)果顯示,癌旁正常組織中高危型HPV E2 mRNA的表達(dá)(0.87± 0.31)顯著增高,但其相對(duì)應(yīng)的宮頸癌組織中高危型HPV E2 mRNA的表達(dá)明顯減少(0.35 ± 0.16),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測(cè)高危型HPV E2蛋白的表達(dá)水平表明,宮頸癌組織中高危型HPV E2蛋白明顯減少(0.26 ± 0.12),與相應(yīng)的宮頸癌旁正常組織(0.74 ± 0.36)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中,老年組高危型HPV E2(0.28 ± 0.14)在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著低于非老年組(0.76 ± 0.29)(P<0.01)。

2.2高危型HPV E2對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa增殖及凋亡的影響采用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染高危型HPV E2質(zhì)粒,對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa增殖的影響,高危型HPV E2組,其細(xì)胞存活率與PBS組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但空載體組與PBS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。宮頸癌細(xì)胞的凋亡情況,高危型HPV E2組,其凋亡細(xì)胞數(shù)與PBS組比較顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但空載體組與PBS比較,其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

項(xiàng)目高危型HPVE2空載體PBS存活率24±4**78±882±9凋亡率83±9**28±331±4

注:與PBS組比較,**P<0.01

3　討論

世界上宮頸癌新發(fā)病例47萬例/年,其中中國占新發(fā)病例總數(shù)的28.8%[4]。宮頸癌的病因?qū)W研究已經(jīng)證實(shí),高危型HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌及其相關(guān)病變的重要因素[5],因此深入探索高危型HPV感染對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病早期防治的一個(gè)熱點(diǎn)研究內(nèi)容。

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)調(diào)查顯示,宮頸癌在中老年婦女發(fā)生率較高,與年輕婦女相比,其也有較高的死亡率。高危型HPV16、18型與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān),其感染宮頸上皮的基底細(xì)胞和基底周圍細(xì)胞后,其基因片段或者整個(gè)DNA可以整合到宿主細(xì)胞基因組中。早期編碼區(qū)(early region,E區(qū))起始編碼E1、E2、E5、E6、E7蛋白,其中高危型HPV E2、E6、E7基因與HPV致瘤密切相關(guān)[6]。本研究結(jié)果揭示:不僅宮頸癌組織中高危型HPV E2基因明顯少于相應(yīng)的宮頸癌旁正常組織,而且老年組高危型HPV E2在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著低于非老年組,表明老年人宮頸癌的高發(fā)生率與致死率與高危型HPV E2表達(dá)有密切的相關(guān)性。

研究揭示,高危型HPV E2既調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄又調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制,且通過多種途徑影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。作為一種反式調(diào)控因子,其可通過控制E6和E7基因的持續(xù)表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞的增殖[7],可通過調(diào)控p53和pRB蛋白誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡[8]、也可通過引發(fā)線粒體功能障礙導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞凋亡[9]。本研究結(jié)果揭示,高危型HPV E2可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖活性,導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。以上結(jié)果提示,高危型HPV E2在宮頸癌細(xì)胞中的低表達(dá),使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡得以發(fā)生無限增殖。如果將高危型HPV E2作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn),進(jìn)而尋找有效高危型HPV E2表達(dá)的新療法,從而提高傳統(tǒng)宮頸癌療法的效果具有重要的臨床意義。

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南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金(YKK14123)

210004江蘇省南京市,南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院檢驗(yàn)科

高玲娟，Email：gaolingjuan@njmu.edu.cn

R 737.33

Bdoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.03.021

2015-05-21)