馬 超 馮文華 韓維田

遼寧省計劃生育科學(xué)研究院分子遺傳實驗室(沈陽，110031)

·技術(shù)與方法·

HRM技術(shù)在掌跖角化病KRT9基因致病突變檢測中的應(yīng)用

馬 超 馮文華 韓維田*

遼寧省計劃生育科學(xué)研究院分子遺傳實驗室(沈陽，110031)

目的：建立一種低成本、高通量、簡便易行、準(zhǔn)確可靠的檢測掌跖角化病致病突變的方法。方法:應(yīng)用高分辨率熔解曲線(HRM)方法檢測掌跖角化病患者KRT9基因第一外顯子突變情況，并與測序結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果:HRM方法能準(zhǔn)確區(qū)分野生型和雜合型致病突變536T>C、548A>G，測序結(jié)果與 HRM 結(jié)果完全一致。結(jié)論:HRM方法能簡單快速、準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)地檢測KRT9基因突變，能用于掌跖角化病患者的大樣本臨床初篩。

掌跖角化病；高分辨率熔解曲線；角蛋白9

掌跖角化病(PPK)是一組以手掌和足跖角化過度為特點的慢性皮膚病。大多為遺傳性, 有家族史，按遺傳方式可分為常染色體顯性遺傳類型,如表皮松解性掌跖角化病(EPPK, OMIM 144200)、Greither病、掌跖角化病伴發(fā)食管癌等,和較為罕見的常染色體隱性遺傳類型,如Meleda 病、Papillon-lefevre綜合征等。其中,EPPK較為常見, 表現(xiàn)為彌漫性、斑塊狀、有清晰紅色邊緣的角質(zhì)增厚, 表面光滑、色黃, 局限在掌跖處的皮膚病變。Reis等[1-2]首次將與EPPK相關(guān)的基因定位在染色體17q12-q21上，并在位于該區(qū)域的角蛋白9基因(KRT9)中檢測到一個點突變R162W。迄今為止，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)在不同的EPPK家系中檢測到了20多種不同的突變, 絕大多數(shù)突變集中于KRT9 基因第1外顯子區(qū)域，此區(qū)域成為EPPK的突變熱點區(qū)。目前，檢測基因突變的方法很多，如PCR產(chǎn)物直接測序法、PCR-Taqman探針法、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)等。這些方法存在著成本高、操作復(fù)雜或靈敏度低等問題，不利于臨床大樣本初篩。高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)是近年來在傳統(tǒng)突變檢測方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于臨床大樣本已知突變初篩的新技術(shù)，它的作用原理是在PCR基礎(chǔ)上通過飽和染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化進(jìn)而進(jìn)行基因分型[3]。為了建立一個簡便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的掌跖角化病已知突變基因的大樣本初步篩查檢測平臺，我們擬采用HRM 技術(shù)對來自于兩個EPPK遺傳家系的患者和正常人對照進(jìn)行KRT9基因第1外顯子的突變檢測，并通過基因測序?qū)RM檢測結(jié)果進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取來自于兩個獨立EPPK遺傳家系的患者各2名和家系中正常人對照各1名。所有患者均在中國醫(yī)科大學(xué)確診為EPPK，排除其他相似的手足疾病。

1.2 儀器及試劑

高分辨率熔解曲線分析儀Light Scanner(Idaho Technology Council公司, 美國)，全基因組核酸提取試劑盒(TIANGEN公司,中國)，rTaq DNA聚合酶(TAKARA,日本)。采用Primer5軟件設(shè)計KRT9基因第1外顯子HRM引物，引物序列為：上游：5'GGTGGTATTCTGACTGCTAA 3'，下游：5' TATTCTCCAGGTCGTTGTT 3'，產(chǎn)物長度為115bp。

1.3 全基因組DNA 提取

抽取患者及正常人對照靜脈全血，用TIANGEN全基因組核酸提取試劑盒提取6例全血樣品中的DNA，用Nano Drop1000紫外分光光度計測定核酸濃度，并全部標(biāo)準(zhǔn)化為100 ng/μl。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為20μl，其中包括基因組 DNA 1μl， LC green染料2μl。PCR退火溫度為55℃。

1.5 HRM檢測及分析

將PCR反應(yīng)后的96孔板取出，每個反應(yīng)孔中加入 1滴礦物油，離心后用Light Scanner檢測各產(chǎn)物熔解曲線。分析方法采用HRM軟件直接篩查法(Scanning法)，擴(kuò)增子分型的相關(guān)參數(shù)為：溫度范圍84.7～88.5℃，敏感度-0.6。

1.6 樣品測序

將各樣品PCR擴(kuò)增80μl后，送至北京博邁德生物有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 HRM檢測

HRM的基因分型結(jié)果顯示，根據(jù)熔解曲線(圖1A)和熔解峰形(圖1B)的差異，所有檢測樣品被分成3組，其中兩個正常人為一組，家系1中的2名EPPK患者被分到同一組，家系2中的2名EPPK患者為第3組。每組曲線之間差異明顯。結(jié)果說明檢測樣本中包含KRT9基因第1外顯子的3種基因型。

2.2 測序

將6個樣品進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示家系1中2名EPPK患者均存在KRT9基因536T>C雜合突變，家系2中2名EPPK患者均存在KRT9基因548A>G雜合突變，2名正常人均不存在KRT9基因突變(圖1C)。測序分組結(jié)果與HRM分組結(jié)果完全一致。

A:熔解曲線圖 B:熔解峰形圖 C:測序結(jié)果圖(野生型、536 T>C雜合突變和548 A>G雜合突變)

圖1 樣本檢測結(jié)果

3 討論

由于掌跖角化過度，患者的掌跖皮膚變得粗糙甚至龜裂，嚴(yán)重者出現(xiàn)行走疼痛，影響到正常的工作和生活。另外雖然掌跖角化病本身并不會致死、致殘, 但這些家系患者對于一些危害嚴(yán)重的疾病如癌癥、聽力喪失及心力衰竭等具有遺傳易患性[4]，因而掌跖角化病致病基因變異大樣本檢測平臺的建立, 既能幫助臨床準(zhǔn)確診斷此類疾病，也能為基因治療的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

HRM技術(shù)是基于核酸的物理性質(zhì)，通過飽和染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化來分析核酸性質(zhì)差異的一種技術(shù)，它是在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上增加一種飽和染料LC Green，無需使用序列特異性探針，不受突變堿基位點和種類的局限，具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、低成本、高通量、閉管操作等優(yōu)點，可檢測石蠟包埋組織塊、血液等多種來源標(biāo)本[5]。在利用 HRM 擴(kuò)增含突變位點基因的過程中，由于突變位點不匹配、缺失、插入都會導(dǎo)致雙鏈DNA 在升溫過程中會先解開，熒光染料從局部解鏈的 DNA 分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時間曲線上就可以判斷是否存在突變位點。而且不同突變位點、雜合子存在與否等都會影響熔解曲線的峰形，因此，HRM 分析能夠有效區(qū)分不同突變位點與不同基因型。HRM技術(shù)既可以對未知突變進(jìn)行篩查、掃描，又可以對已知突變進(jìn)行分析，亦可用于短片段重復(fù)序列的分析。所以，相比傳統(tǒng)的SNP/突變分析法和定量探針法，HRM簡化了操作時間和步驟，大大降低了使用成本。由于HRM對PCR產(chǎn)物沒有破壞性，所以在通過HRM初篩后的PCR產(chǎn)物，還可以再進(jìn)行測序來檢測無法用 HRM進(jìn)行基因分型和序列匹配的序列，因此，HRM可以減少95%以上的測序工作量，適用于臨床大樣本的初步篩查。

值得注意的是由于目前技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)的應(yīng)用定位于臨床大樣本已知突變的篩檢，用此方法開展基因診斷和產(chǎn)前診斷不符合分子診斷技術(shù)方面的要求。該技術(shù)在人群篩查方面應(yīng)當(dāng)有應(yīng)用價值，在遺傳病基因診斷方面價值一般。

在本研究中我們確定了HRM方法檢測KRT9基因第1外顯子的兩個常見雜合突變的實驗條件，將已經(jīng)確定的基因型作為標(biāo)準(zhǔn)化樣本，可以直接應(yīng)用于后續(xù)更多掌跖角化病患者的已知基因變異的初步篩查。另外在后續(xù)的研究中我們會繼續(xù)添加已知的、尋找未知的掌跖角化病的致病位點，逐步完善以HRM技術(shù)為基礎(chǔ)的掌跖角化病致病基因變異大樣本初步篩查檢測平臺。

[1] Reis A, Kuster W, Eckardt R, et al. M app ing of a gene for epidermolytic palmoplantar keratoderma to the region of the acidic keratin gene cluster at 17q122q21 [J]. Hum Genet, 1992, 90:113-116.

[2] Reis A , Hennies HC, Langbein L, et al. Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK) [J]. Nat Genet, 1994, 6:174-179.

[3] Kramer D，Thunnissen FB，Gallegos-Ruiz MI，et al．A fast, sensitive and accurate high resolution melting (HRM) technology-based assay to screen for common K-ras mutations [J]. Cell Oncol, 2009, 31:161-167．

[4] Kelsell DP, Stevens HP. The palmoplantar keratodermas: much more than palms and soles [J]. Mol Med Today, 1999, 5(3):107-113.

[5] Tong SY, Giffard PM. Microbiological applications of high-resolution melting analysis [J]. Clin Microbiol, 2012, 50(11):3418-3421.

[責(zé)任編輯：王麗娜]

Application of HRM technology in detecting KRT9 gene pathogenic mutation of patients with palmoplantar keratoderma

MA Chao, FENG Wenhua, HAN Weitian

MolecularGeneticsLaboratory，LiaoningProvinceResearchInstituteofFamilyPlanning，Liaoning,110031

*Correspondauthor：hwtzzf@sohu.com

Objective: To establish a detecting method with low cost, high throughput, simple, accurate and reliable for detecting pathogenic mutation of patients with palmoplantar keratoderma. Method： The first exon mutation of KRT9 gene of patients with palmoplantar keratoderma were detected by high resolution melting (HRM) method, and the result then was compared with the result by sequencing. Result：HRM method had accurately distinguish wild type and heterozygous mutation 536T>C, 548A>G, which was consistent with sequencing results. Conclusion：HRM is a simple, fast, accurate and cost-efficiency method to detect the KRT9 gene mutations, so it is suitable for preliminary gene screening for patients with palmoplantar keratoderma.

Palmoplantar keratoderma; High resolution melting (HRM); Keratin 9 (KRT9)

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目(2012225017)

2015-06-29

2016-07-12

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.08

*通訊作者：hwtzzf@sohu.com