孫菊香 丁明霞 李學(xué)博 李華峰

1.山東省臨沂市人民醫(yī)院 (276000)；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院；3.山東政法學(xué)院證據(jù)鑒識省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.山東省臨沂市婦幼保健院

IdentifilerTM系統(tǒng)在產(chǎn)前染色體非整倍體快速檢測中的應(yīng)用

孫菊香1丁明霞2李學(xué)博3*李華峰4

1.山東省臨沂市人民醫(yī)院 (276000)；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院；3.山東政法學(xué)院證據(jù)鑒識省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.山東省臨沂市婦幼保健院

染色體異常是嚴(yán)重的先天性疾病，由于其不可治愈，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，產(chǎn)前診斷作為二級預(yù)防措施一直是降低此類疾病發(fā)生率的主要途徑[1]。短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)多態(tài)性符合孟德爾遺傳規(guī)律，具有雜合性高、多態(tài)信息量大和高靈敏度等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)親子鑒定、個體識別及人類進(jìn)化等研究中[2]。本研究利用IdentifilerTM體系對108例產(chǎn)前診斷常規(guī)樣本檢測分析，與常規(guī)細(xì)胞染色體培養(yǎng)方法比較，分析其在產(chǎn)前診斷篩查的效果。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

2013年1月～2014年12月在臨沂市人民醫(yī)院、山東大學(xué)第二醫(yī)院，臨沂市婦幼保健院接受遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷的樣本，按照知情同意的原則取樣共108例，其中羊水88例、臍血12例、絨毛8例。受試孕婦平均年齡38.5(22～46)歲，采集羊水標(biāo)本者平均孕周為21.2(16～23)周；采集臍血標(biāo)本者平均孕周為29.8(25～35)周；采集絨毛標(biāo)本者平均孕周為10.6(9～12)周。以上受檢孕婦具有以下產(chǎn)前診斷指征：唐氏篩查高風(fēng)險52例，35歲以上高齡孕婦26例，不良孕產(chǎn)史28例，胎兒超聲診斷畸形4例，有害物質(zhì)接觸史9例，夫婦中一方染色體異常3例，其中多例具有兩種及以上產(chǎn)前診斷的指征。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1羊水采集 在B超引導(dǎo)下，以21GPTC穿刺針經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，在羊水暗區(qū)最深處抽取羊水20ml，棄去最初的0.2～0.5ml，置入無菌管中，取3 ml進(jìn)行STR分型檢測，其余送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)行常規(guī)染色體核型分析。

1.2.2 絨毛采集 在B超引導(dǎo)下行經(jīng)宮頸絨毛活檢術(shù)，挑選吸出的絨毛置無菌生理鹽水洗滌3～5次，倒置顯微鏡下去除血液、脂肪及蛻膜等組織，將絨毛剪成粥樣。大部分接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行染色體核型分析，剩余部分用于STR分型檢測。

1.2.3 臍血采集 B超觀察臍帶在羊水中的走向，確定臍帶縱切面后，以22GPTC穿刺針經(jīng)腹行臍靜脈穿刺術(shù)。抽取臍血約3ml置無菌管中，1ml用于STR分型檢測，2ml用于細(xì)胞培養(yǎng)后常規(guī)染色體核型分析。

1.3 染色體核型分析

每例樣本均行常規(guī)染色體核型分析，具體方法見參考文獻(xiàn)[3]。

1.4 STR分型檢測

chelex法提取樣本DNA，以IdentifilerTM試劑盒進(jìn)行STR多位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μl，其中包含Reaction Mix 4μl，Primer 2μl，ddH2O 2.8μl，Taq聚合酶0.2μl和DNA 模板1μl。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95℃ 11 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，28個循環(huán)；60℃延伸60 min；4℃保存，每組均設(shè)置陰性及陽性對照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

擴(kuò)增結(jié)束后以ABI 3130XL型遺傳分析儀檢測，電泳結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件分析。STR基因座的不同峰表示不同長度的等位基因，峰面積代表擴(kuò)增產(chǎn)物量。通過計(jì)算該STR位點(diǎn)的峰數(shù)量和峰面積比率進(jìn)行判斷，其中常染色體位點(diǎn)出現(xiàn)單峰無診斷意義，所得STR分型圖譜均與已知分型結(jié)果比對。對兩種方法的結(jié)果以SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對不同樣本的檢測情況

IdentifilerTM試劑盒對108例不同種類樣本的STR分型檢測，6h內(nèi)均完成檢測并獲得結(jié)果，成功率為100%。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析過程中，12例臍血培養(yǎng)均獲成功，成功率100%；88例羊水樣本培養(yǎng)成功85例，成功率96.6%；8例絨毛均培養(yǎng)成功7例，成功率87.5%。所有樣本培養(yǎng)成功率為96.3%。

2.2 兩種方法對不同產(chǎn)前斷指征樣本的檢測情況

兩種方法均檢出8例染色體數(shù)目異常，其中包括4例21三體；2例18-三體；1例13-三體；1例47，XYY，見表1；兩種方法對染色體數(shù)目異常的檢測結(jié)果符合率達(dá)100%。檢測結(jié)果中染色體異常電泳圖譜見圖1。

表1 兩種方法對不同產(chǎn)前診斷指征樣本的檢測結(jié)果

圖A為1號21三體樣本；圖B為4號18三體樣本

圖1 部分樣本的D21S11基因座檢測結(jié)果

3 討論

產(chǎn)前診斷是預(yù)防和干預(yù)出生缺陷的重要手段，傳統(tǒng)的以染色體核型分析為主的細(xì)胞遺傳學(xué)方法一直是公認(rèn)的染色體疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。由于羊水穿刺屬于有創(chuàng)性醫(yī)療技術(shù)，對孕婦和胎兒有一定潛在危險。為了保證羊水細(xì)胞活力提高培養(yǎng)的成功率，羊膜腔穿刺的時間一般限定在孕16～22周[4]。由于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)核型分析需要將羊水細(xì)胞培養(yǎng)至分裂中期，然后進(jìn)行染色體制備，并進(jìn)行人工鏡下分析，其操作過程繁雜[5]，一旦出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)失敗的情況，孕婦可能已經(jīng)錯過了再次復(fù)查的最佳孕周，導(dǎo)致產(chǎn)前檢查及診斷的困難，給孕婦帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)[1]。因此，建立簡便、有效的孕期染色體核型分析樣本篩查新方法，可提高常規(guī)核型分析的針對性和準(zhǔn)確性，具有重要的臨床意義。

染色體數(shù)目異常是臨床上最主要的染色體疾病，約占出生缺陷患兒的80%～90%，其中主要系21、18、13、X與Y染色體非整倍體所致[6-7]。IdentifilerTM系統(tǒng)是美國應(yīng)用生物公司開發(fā)的用于親權(quán)鑒定的商業(yè)試劑盒，引物由5色熒光標(biāo)記，可對包含13、18、21號染色體的15個STR基因座和1個性別位點(diǎn)進(jìn)行檢測，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢案中。利用該方法，對樣本STR基因座進(jìn)行分型可確定胎兒是否存在主要染色體非整倍體。由于該技術(shù)可在羊膜腔穿刺后6h內(nèi)完成檢測，大大縮短了檢驗(yàn)周期，對于細(xì)胞的分裂周期沒有特殊的要求，標(biāo)本來源豐富，無需細(xì)胞培養(yǎng)，因此非常適合產(chǎn)前診斷樣本的快速篩查。由于樣本羊水量可縮減至1～2ml，對羊水較少的個體更具臨床優(yōu)勢[2，7]。

本研究利用絨毛、臍血和羊水細(xì)胞進(jìn)行檢測，均成功獲得了STR分型結(jié)果，且與細(xì)胞培養(yǎng)核型分析結(jié)果一致，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。對于出現(xiàn)核型數(shù)目異常的個體，如果能夠獲得父母樣本，還可以對數(shù)目異常的核型染色體來源進(jìn)行分析，以便制定更好的醫(yī)療干預(yù)或預(yù)防措施。產(chǎn)前診斷檢測樣本的多樣化具有重要的臨床意義[4]，本方法對臍血和絨毛細(xì)胞檢測同時有效，使檢出率大大提高，擴(kuò)大了樣本選擇的范圍，受孕周限制小，提示該技術(shù)具有較高的臨床應(yīng)用價值。

當(dāng)前常用的親子鑒定試劑盒均包含有13、18、21號染色體的基因座，因此可作為傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析的篩選及輔助檢測手段，以提高檢出率及準(zhǔn)確性。但由于該方法只能根據(jù)某一基因座等位基因分析檢測特定的染色體數(shù)目異常，對染色體結(jié)構(gòu)平衡變異的檢測仍存在局限性。因此，不斷探索多個基因座的聯(lián)合檢測技術(shù)和試劑盒，可大大提高檢測準(zhǔn)確性并降低診斷成本，同時兼顧結(jié)構(gòu)異常檢測技術(shù)的創(chuàng)新，是該方法努力和發(fā)展的方向。

[1] 王樹玉, 黃醒華, 賈嬋維, 等. 國產(chǎn)探針熒光原位雜交技術(shù)用于產(chǎn)前診斷未培養(yǎng)羊水細(xì)胞染色體異常的研究 [J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2009,44(7):492-497.

[2] Agarwal S, Srinivasan M, Phadke S. STR markers in clinics: A rapid prenatal diagnosis by quantitative fluorescent-pcr for aneuploidies [J]. Mol Cytogenet, 2014,7(Suppl 1 Proceedings of the International Conference on Human):I58.

[3] Xu AQ, Xia M, Liu JT, et al. Validation of quantitative fluorescent-PCR for rapid prenatal diagnosis of common aneuploidies in the chinese population [J]. Genet Mol Res, 2013,12(4):6379-6388.

[4] 張靜引, 孫麗洲, 肖云山, 等. 改良熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用 [J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展, 2009,18(6):442-445.

[5] Garcia-Sagredo JM. Fifty years of cytogenetics: A parallel view of the evolution of cytogenetics and genotoxicology [J]. Biochim Biophys Acta, 2008,1779(6-7):363-375.

[6] Weise A, Liehr T. Rapid prenatal aneuploidy screening by fluorescence in situ hybridization (FISH) [J]. Methods Mol Biol, 2008,444:39-47.2008:39-48.

[7] 許涓涓, 杜娟, 鄭陳光, 等. 單管多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)用于染色體非整倍體異常的產(chǎn)前診斷 [J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2010,45(11):865-869.

[責(zé)任編輯：董 琳]

臨沂市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(NO.201413017)，山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014HQ018)

2015-08-07

2016-07-01

*通訊作者:lysjx2012@126.com