王蓮，王嵐，楊博涵，龐文悅，張榮泉（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020）

雙葉顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

王蓮，王嵐，楊博涵，龐文悅，張榮泉*
（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020）

建立功能食品雙葉顆粒的質(zhì)量控制方法。采用紫外分光光度法測定雙葉顆粒中總黃酮含量，并對其方法學(xué)進(jìn)行考察；同時(shí)對其理化和微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測?？傸S酮含量在0.00～45.60μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 7，平均加樣回收率為98.92%，RSD為1.43%。

雙葉顆粒；柿葉；山楂葉；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

柿葉系柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的新鮮或干燥葉子，具有清熱解毒、潤肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌等多種醫(yī)療保健功能[1]；山楂葉系薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥葉，能夠消食健胃、行氣散瘀[2]。二者均含有豐富的黃酮類化合物，可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝功能，保護(hù)心腦血管系統(tǒng)。目前，柿葉與山楂葉已被列入到國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品原料名稱目錄征求意見稿當(dāng)中，其保健價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值得到了社會與專家的廣泛認(rèn)可。

我國是世界上最主要的柿樹及山楂樹生產(chǎn)國，柿葉和山楂葉資源十分豐富。但是長期以來，人們對葉片資源不夠重視，致使這一保健資源被一再忽視。雙葉顆粒就是以柿葉和山楂葉提取物為主要原料，研發(fā)制備出的能夠有效調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝的功能食品。為了能夠更為有效準(zhǔn)確地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本文擬建立操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好的總黃酮含量控制方法，并對其理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)進(jìn)行考察，從而建立一個(gè)準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

原料：柿葉與山楂葉均產(chǎn)自天津市薊縣黃崖關(guān)，經(jīng)鑒定為柿科植物柿的干燥葉及薔薇科植物山楂的干燥葉，自然晾干。

微晶纖維素：遼寧奧達(dá)制藥有限公司；乳糖：DAVISCO FOODS INTERNATIONAL.INC；玉米淀粉：河北海玉食品有限責(zé)任公司；糊精：遼寧奧達(dá)制藥有限公司；砂糖：廣東恒福糖業(yè)集團(tuán)有限公司，粉碎，過100目篩網(wǎng)。

甲醇（優(yōu)級純），無水乙醇、苯、石油醚均為分析純：天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；聚酰胺粉（100目～200目）：江蘇長豐化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（10080-200707）：中國藥品生物制品鑒定所。

1.2儀器與設(shè)備

SPECORD 210 PLUS紫外可見光分光光度計(jì)：德國耶拿；AFS-933原子熒光光度計(jì)：北京吉天儀器有限公司；nov400P原子吸收分光光度計(jì)：德國耶拿；MD7微波消解儀：美城；AB204-E電子天平（精確值0.000 1 g）：METTLER TOLEDO；KQ-100超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DL-203B電熱干燥箱：天津?qū)嶒?yàn)儀器廠；LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；DL-Ⅰ-15臺式封閉電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；SHH.W21.CR420恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠；2B型干燥箱：南京長江制藥機(jī)械設(shè)備廠；YK160A型搖擺式制粒機(jī)、CH200A槽式混合機(jī)：江蘇常州市雙東制藥機(jī)械廠。

2　試驗(yàn)方法

2.1雙葉顆粒的制備

將采集得到的柿葉、山楂葉分別干燥粉碎為粗粉，用適當(dāng)溶劑進(jìn)行煎煮提取，提取液濃縮為浸膏，加入規(guī)定濃度與用量的潤濕劑，攪拌制軟材，14目篩網(wǎng)制粒，60℃干燥后14目篩網(wǎng)整粒，并用80目篩網(wǎng)篩除細(xì)粉，備用。

2.2總黃酮含量質(zhì)量控制

柿葉和山楂葉中含有豐富的黃酮類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道其可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝功能，故本文將總黃酮含量作為該顆粒質(zhì)量控制的重要標(biāo)志成分，并對其含量檢測方法進(jìn)行方法學(xué)研究。

2.2.1溶液制備

2.2.1.1對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品約20.0 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，得蘆丁對照品溶液。

2.2.1.2供試品溶液的制備

精密稱取供試品約1.0 g，置索氏提取器中，加入石油醚加熱回流提取至提取液無色，棄去石油醚液，樣渣揮去石油醚，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，離心，取上清液為供試品溶液。

2.2.2全波長掃描

取蘆丁對照品溶液進(jìn)行顯色，以試劑為空白，用紫外分光光度儀在190 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，選擇最佳測定吸收波長。

2.2.3線性關(guān)系考察

精密吸取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，加水至刻度，放置15 min，以0.0 mL對照品溶液制得的溶液作為空白，于波長510 nm比色測定，進(jìn)行線性關(guān)系考察，計(jì)算回歸方程。

2.2.4精密度

取蘆丁對照品溶液連續(xù)比色6次，計(jì)算測定結(jié)果的RSD值。

2.2.5穩(wěn)定性

取供試品溶液，分別于0、10、20、30、40、50、60 min在波長510 nm處進(jìn)行比色測定，記錄不同時(shí)間測定的吸光度，計(jì)算RSD值。

2.2.6重復(fù)性

精密稱取約1.0 g的雙葉顆粒試樣6份，按照2.2.1.2項(xiàng)制成供試品溶液，于波長510 nm處比色測定，分別計(jì)算各試樣的總黃酮含量和RSD值。

2.2.7回收率

精密稱取約0.6 g的雙葉顆粒試樣9份，分別加入一定量的對照品溶液，按照2.2.1.2項(xiàng)制成供試品溶液，于波長510 nm處比色測定，計(jì)算其總黃酮含量和RSD值。

2.2.8供試品測定

分別精密稱取3批雙葉顆粒（批號為：201401，201402，201403）約1.0 g，按照2.2.1.2項(xiàng)進(jìn)行供試品前處理，并于波長510 nm處比色測定，計(jì)算總黃酮含量。

2.3感官指標(biāo)

取少量雙葉顆粒樣品，在自然光下肉眼觀察其組織形態(tài)、色澤、雜質(zhì)等情況，嗅其氣味，品其滋味。

2.4理化指標(biāo)測定

為進(jìn)一步完善該顆粒劑產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在建立了總黃酮含量檢測方法的基礎(chǔ)上，依據(jù)食品國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》、GB 5009.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》、GB 5009.11-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定》、GB 5009.17-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測定》、GB 5009.12-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測定》、GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》）及中國藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]對成品顆粒的水分、灰分、總砷、總汞、鉛、鎘、溶化性等理化指標(biāo)進(jìn)行檢測。

2.5微生物指標(biāo)測定

按照國家食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》、GB 4789.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》、GB 4789.15-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》、GB 4789.10-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》、GB 4789.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》），對其微生物常規(guī)檢測項(xiàng)目（菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母）和致病菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）進(jìn)行了微生物檢測，為最終質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。

3　試驗(yàn)結(jié)果

3.1總黃酮含量質(zhì)量控制

3.1.1全波長掃描

全波長掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁對照品溶液在波長510 nm處存在最大吸收（圖1），與參考文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致，故選擇510 nm作為檢測波長。

圖1　蘆丁全波長掃描圖Fig.1　The fullwavelength scan ofrutin

3.1.2線性關(guān)系考察

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁對照品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），線性回歸方程為Y=0.012 8X－0.005 3（r=0.999 7）。結(jié)果表明，蘆丁試樣在0.00～45.60μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖2　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2　The standard curve ofrutin

3.1.3精密度

以蘆丁對照品溶液連續(xù)檢測6次，測定吸光度值，計(jì)算總黃酮的RSD為0.04%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.1.4穩(wěn)定性

取同一供試品溶液，分別于顯色后0、10、20、30、 40、50、60 min測定吸光度，吸光度值未出現(xiàn)明顯降低，RSD為0.23%，檢測方法穩(wěn)定性良好。

3.1.5重復(fù)性

將制備得到的6份供試品溶液分別顯色，測定吸光度值，計(jì)算總黃酮含量，RSD為1.83%，表明重復(fù)性良好。

3.1.6回收率

將9份供試品溶液進(jìn)行顯色測定，總黃酮加標(biāo)回收率在97.39%-102.27%之間，RSD為1.43%，結(jié)果見表1。

表1　回收率測定結(jié)果Table 1　The results ofthe recovery detection

3.1.7供試品總黃酮含量測定

對3批雙葉顆粒試樣分別進(jìn)行比色測定，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表2，3批產(chǎn)品總黃酮含量未有顯著性差異，質(zhì)量穩(wěn)定。

表2　供試品測定結(jié)果Table 2　The results oftotalflavonoids detected

3.2感官指標(biāo)

雙葉顆粒產(chǎn)品為黃棕色顆粒，色澤均勻，無異味，無肉眼可見的外來雜質(zhì)。

3.3理化指標(biāo)測定

按照試驗(yàn)確定工藝參數(shù)，生產(chǎn)雙葉顆粒產(chǎn)品，其理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，污染物以及重金屬限量測定結(jié)果含量較低，符合（GB 16740-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)保健食品》）中的相關(guān)規(guī)定，確保了產(chǎn)品的安全性。

表3　產(chǎn)品理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 3　The results of physicaland chemicalindicators detected

3.4微生物指標(biāo)測定

按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)檢測雙葉顆粒中微生物指標(biāo)，檢測結(jié)果見表4，各項(xiàng)檢測結(jié)果均符合國家保健食品微生物限度要求，表明產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量良好。

表4　產(chǎn)品微生物指標(biāo)檢測結(jié)果Table 4　The results ofmicrobialindicators detected

4　結(jié)論與討論

1）試樣經(jīng)預(yù)處理除雜后，以甲醇超聲提取黃酮類成分。該類成分被亞硝酸鈉還原，與硝酸鋁形成絡(luò)合物，在氫氧化鈉溶液堿性條件下開環(huán)，生成2-羥基查爾酮而使溶液顯特征橙紅色，在510 nm處有最大吸收，且呈色穩(wěn)定，通過紫外分光光度計(jì)測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2）本文采用紫外分光光度法測定雙葉顆粒中的總黃酮含量，其含量在0.00～45.60μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 7，平均加標(biāo)回收率為98.9%，RSD為1.43%。試驗(yàn)結(jié)果表明，該測定方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可有效控制中間體顆粒及成品的質(zhì)量。

3）總黃酮提取溶劑的選擇：目前總黃酮提取方法多采用水提法與醇提法，水提法成本低、操作性強(qiáng)但提取率較低，多用于工業(yè)生產(chǎn)原料提??；醇提法提取率高、提取雜質(zhì)少，更適于樣品含量檢測前處理。針對醇提法，本試驗(yàn)進(jìn)一步比較了甲醇與乙醇的樣品總黃酮提取效果，多次試驗(yàn)結(jié)果表明甲醇的總黃酮提取率是乙醇的10倍左右，故選擇甲醇作為總黃酮含量測定的提取溶劑。

4）根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》要求，在總黃酮含量測定過程中，樣品前處理采用先超聲提取，再轉(zhuǎn)入層析柱進(jìn)行洗脫的方法，結(jié)果顯示總黃酮樣品回收率偏低，處理過程中有可能存在總黃酮收集洗脫段不準(zhǔn)確，總黃酮出現(xiàn)損失的問題，此法是否適于雙葉顆粒成品的檢測值得商榷。因此，本文對成品中總黃酮的提取和檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，考察并驗(yàn)證了相關(guān)的方法學(xué)，其結(jié)果良好。

5）柿葉和山楂葉為葉片型原料，葉綠素等雜質(zhì)成分含量較高，對總黃酮顯色測定具有較大的影響[5]，故樣品除雜步驟是必要的。目前，除雜試劑多采用苯、甲苯、石油醚等，經(jīng)試驗(yàn)比較，其對總黃酮檢測結(jié)果未有顯著性影響，且苯類試劑具有一定毒性，故采用石油醚作為除雜試劑進(jìn)行索氏提取，該操作過程相對復(fù)雜，對操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高，故重復(fù)性試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差稍高（RSD=1.83%），但樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品的前處理對總黃酮含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確度影響不大。

[1] 王燕.柿葉中黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7 (4):173-174

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部.[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:32

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:四部.[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:8

[4]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社, 2011:122-124

[5] 王蓮,米沙,龐文悅,等.比色法測定柿葉中總黃酮的含量[J].食品研究與開發(fā),2012,33(6):122-127

Study on Quality Standard of Shuangye Granule

WANG Lian，WANG Lan，YANG Bo-han，PANG Wen-yue，ZHANG Rong-quan*
（Tianjin Institute of Pharmaceuticaland Medical Science，Tianjin 300020，China）

To develop a method ofquality controlfor Shuangye granule，the content oftotal flavonoids was determined by ultraviolet spectrophotometry and the methodology was studied；the physical，chemical and microbial indicators were detected.Total flavonoids had a good linearity over the concentration range of 0.00-45.60μg/mL（r=0.999 7）.The average recoveries was 98.92%with relatively standard deviations of1.43%.

Shuangye granule；persimmon leaf；hawthorn leaf；quality standard

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.034

王蓮（1982—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事天然產(chǎn)品和保健食品的研發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

張榮泉（1964—），男，研究員，研究方向：中藥、天然藥物的開發(fā)及研究、保健食品的研究開發(fā)申報(bào)及生產(chǎn)。

2016-01-29