趙巖，趙天琦，徐殿文，郜玉鋼，蔡恩博，劉雙利，楊鶴，張連學(xué)，*（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春308；.沈陽(yáng)軍區(qū)洮南訓(xùn)練場(chǎng)，吉林白城3700）

柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定仙鶴草中氨基酸含量

趙巖1，趙天琦1，徐殿文2，郜玉鋼1，蔡恩博1，劉雙利1，楊鶴1，張連學(xué)1，*
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.沈陽(yáng)軍區(qū)洮南訓(xùn)練場(chǎng)，吉林白城137100）

采用柱前衍生RP-HPLC法對(duì)仙鶴草中游離及水解氨基酸進(jìn)行測(cè)定。以異硫氰酸苯酯為柱前衍生化試劑。以異硫氰酸苯酯為柱前衍生化試劑；色譜柱采用Ultimate Amino Acid氨基酸柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為80%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈-水溶液，流動(dòng)相B為7%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈-CH3COONa溶液（pH=6.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。21種氨基酸在0.001 9μmol/mL～2.700μmol/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.999 0）。21種游離氨基酸平均回收率在95.84%～ 111.34%之間，RSD在1.23%～2.54%之間（n=6）；水解氨基酸平均回收率在90.79%～111.23%之間，RSD在1.29%～ 2.21%之間（n=6）。柱前衍生RP-HPLC法靈敏、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，適合仙鶴草中氨基酸含量測(cè)定。

仙鶴草；柱前衍生；氨基酸；高效液相色譜

仙鶴草（Agrimonia pilosa Ledeb.）為薔薇科多年生草本植物龍牙草的全草，異名脫力草、馬鞭草、龍牙草、石打穿等，始載于《滇南草本》?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，仙鶴草具有收斂止血、截疽、止痢、解毒等作用，主要用于咳血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、脫力勞傷、癰腫瘡毒、陰癢帶下等[1-4]。仙鶴草資源豐富，化學(xué)成分多樣，主要含有仙鶴草素、仙鶴草內(nèi)酯、鞣質(zhì)、甾醇、有機(jī)酸、酚性成分、皂苷、仙鶴草酚（A、B、C、D）、VC、VK等，但對(duì)仙鶴草中的游離氨基酸和水解氨基酸鮮見相關(guān)報(bào)道。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)，也是非常重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理機(jī)能，供應(yīng)機(jī)體的所需能量，但是人體需要的22種氨基酸中，有9種氨基酸是機(jī)體不能自身合成或者合成量不夠的，這就需要從食物藥物中獲取。氨基酸測(cè)定方法有化學(xué)法、分光光度法[5]、色譜法（紙色譜、薄層色譜、氣相色譜和液相色譜）、電化學(xué)法[6]等，其中HPLC法應(yīng)用最為廣泛。本試驗(yàn)為仙鶴草建立了一種方法，先用HCl進(jìn)行水解再用HPLC法測(cè)定游離氨基酸和水解氨基酸的含量，為仙鶴草在藥品和食品上的開發(fā)利用提供參考。

1　材料

1.1原料

仙鶴草采于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)院內(nèi)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張連學(xué)教授鑒定為仙鶴草 （Agrimonia pilosa Ldb.）的全草。

1.2儀器

FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；220V/50Hz超聲波清洗機(jī)：江蘇省昆山市超聲儀有限公司；2XZ-4型旋片式真空泵：上海博一泵業(yè)制造有限公司；HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司；CXTH-3000 HPLC色譜儀：北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

1.3試劑

21種氨基酸對(duì)照品（≥98%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三乙胺：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；除乙腈為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1HPLC條件

Ultimate Amino Acid氨基酸色譜柱（5μm，4.6 mm× 250 mm），柱溫為35℃，UV檢測(cè)波長(zhǎng)是254 nm。流動(dòng)相A是80%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈水溶液，B是7%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈CH3COONa溶液（pH=6.5）。流速為1.0 mL/min。梯度洗脫：0～11 min，0%～6.5%A；11 min～13.9 min，6.5%～11%A；13.9 min～17 min，11%～ 13.4%A；17 min～29 min，13.4%～30%A；29 min～32 min，30%～70%A；32 min～35 min，70%～100%A；35 min～ 42 min，100%A；42 min～45 min，100%～0%A；45 min～ 60 min，0%A。

2.2溶液的制備[7]

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定21種氨基酸，包括天冬酰胺（Asn）、胱氨酸（Cys-Cys）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）、絲氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、谷氨酰胺（Gln），加0.1 mol/L鹽酸溶解，配制除胱氨酸濃度為1.25μmol/mL外、其他氨基酸濃度為2.5μmol/mL的氨基酸混合對(duì)照品溶液，4℃保存，備用。

2.2.2衍生化試劑的制備

衍生化試劑A是20%（體積分?jǐn)?shù)）的三乙胺乙腈溶液，衍生化試劑B是1/80（體積分?jǐn)?shù)）的異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液，均為4℃保存。

2.3對(duì)照品溶液的衍生化

吸取氨基酸混合對(duì)照品溶液200μL，置于1.5 mL離心管中，加入衍生試劑A和B各100μL，搖勻，靜置1 h，加正己烷至800μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45μm濾膜濾過(guò)，取20μL進(jìn)行HPLC分析。

2.4供試品溶液的制備與衍生化

2.4.1游離氨基酸供試品溶液的制備與衍生化

稱取仙鶴草粉末0.500 0 g，加入50%乙醇溶液50 mL，超聲提取兩次，時(shí)間為30 min/次，合并濾液，濾液于80℃水浴揮至近干，蒸餾水溶解于10 mL量瓶中并定容至刻度。吸取1 mL提取液，加入衍生化試劑A100μL，衍生化試劑B100μL，搖勻，靜置1 h，加入正己烷400μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45μm濾膜濾過(guò)，取20μL進(jìn)行HPLC分析。

2.4.2水解氨基酸供試品溶液的制備

稱取仙鶴草粉末0.100 0 g，加入6 mol/L的鹽酸水溶液10 mL、1%的苯酚1 mL，抽取真空狀態(tài)，充足量的氮?dú)?，重?fù)3次，于110℃水解24 h，水解液至于50 mL量瓶中并用蒸餾水定容至刻度。吸取2 mL定容液于80℃水浴揮干，加入蒸餾水洗凈鹽酸。加入2 mL蒸餾水，超聲溶解。吸取1 mL提取液，加入衍生化試劑A100μL，衍生化試劑B100μL，搖勻，靜置1 h，加入正己烷400μL萃取，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45μm濾膜濾過(guò)，取20μL進(jìn)行HPLC分析。

2.5線性關(guān)系考察[8]

取混合氨基酸對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法衍生后按照HPLC條件進(jìn)樣，分析測(cè)定其峰面積，以各種氨基酸的濃度（x，μmol/mL）對(duì)各種氨基酸峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，得21種氨基酸的檢測(cè)濃度在0.001 9μmol/mL～2.700 0μmol/mL范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。21種氨基酸的線性回歸方程及R2值見表1。

表1　21種氨基酸線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)Table 1　Linear regression equation and correlation coefficientof 21 kinds ofamino acids

2.6精密度試驗(yàn)

吸取氨基酸混合對(duì)照品溶液1 mL，按2.3方法衍生后，連續(xù)進(jìn)樣6次，分析測(cè)定氨基酸峰面積。結(jié)果是21種氨基酸峰面積的RSD在0.49%～0.93%之間（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，分別于0、1、2、4、6、8、12、24、36 h進(jìn)樣，分析測(cè)定氨基酸峰面積。結(jié)果是21種氨基酸峰面積的RSD在0.21%～2.79%之間（n=9），表明供試品溶液在36 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批仙鶴草粉末6份，按2.4.1和2.4.2方法制備供試品溶液后，按上述色譜條件進(jìn)樣，分析測(cè)定氨基酸峰面積，計(jì)算氨基酸含量。結(jié)果是21種游離氨基酸百分含量的RSD在1.34%～2.14%之間（n=6），測(cè)定水解氨基酸的21種氨基酸百分含量的RSD在1.14%～2.44%之間（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

2.9.1游離氨基酸的回收率試驗(yàn)

稱取仙鶴草粉末0.250 0 g，加入氨基酸混合對(duì)照品適量，按游離氨基酸檢測(cè)方法分別提取、衍生、進(jìn)樣，重復(fù)6次，計(jì)算游離氨基酸的回收率。結(jié)果是21種游離氨基酸的平均回收率在95.84%～111.34%之間，RSD在1.23%～2.54%之間（n=6）。

2.9.2水解氨基酸的回收率試驗(yàn)

稱取仙鶴草粉末0.050 0 g，加入氨基酸混合對(duì)照品適量，按水解氨基酸檢測(cè)方法分別提取、衍生、進(jìn)樣，平行6次，計(jì)算水解氨基酸的回收率。結(jié)果是21種水解氨基酸的平均回收率在90.79%～111.23%之間，RSD在1.29%～2.21%之間（n=6）。

2.10樣品測(cè)定的結(jié)果

稱取仙鶴草樣品，按上述方法處理，分析測(cè)定，計(jì)算其游離氨基酸和水解氨基酸含量。仙鶴草中21種氨基酸含量見表2。色譜圖見圖1。

表2　仙鶴草中游離氨基酸和水解氨基酸含量Table 2　Species andcontents of the free amino acids and hydrolyzed amino acids in Agrimonia pilosa Ldb.　mg/g

3　結(jié)論與討論

本研究氨基酸提取水解時(shí)用的HCl的濃度很重要，低濃度HCl促進(jìn)色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的水解，但其余氨基酸水解的含量偏低，高濃度的HCl會(huì)解離部分氨基酸。所以分別用1、3、6、12 mol/L的鹽酸進(jìn)行水解，結(jié)果表明，當(dāng)HCl濃度為6 mol/L時(shí)，大部分氨基酸水解效果最好。因此，確定HCl水解的最適濃度為6 mol/L。

分別考察C18色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）、C18色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm）、C18色譜柱（5μm，4.6 mm× 250 mm）、Ultimate Amino Acid氨基酸色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）對(duì)21種氨基酸的分離效果，結(jié)果UltimateAminoAcid氨基酸色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）的分離效果最好。正己烷可以降低剩余的衍生試劑對(duì)色譜柱的損傷，此外在色譜柱前端加上保護(hù)柱，可以減輕試劑對(duì)色譜柱的損傷，延長(zhǎng)色譜柱的使用時(shí)間。

從圖1和表2可以看出，仙鶴草游離氨基酸測(cè)定結(jié)果中含有的21種游離氨基酸。其中，天冬酰胺、精氨酸與谷氨酰胺含量較高，分別為16.452、13.968、5.203 mg/g。由于游離氨基酸可直接被吸收，所以測(cè)定仙鶴草中游離氨基酸的含量是非常必要的。但是某些蛋白質(zhì)難溶于水，在體內(nèi)不能被水解成氨基酸后，導(dǎo)致其利用率降低。經(jīng)酸水解后，仙鶴草中氨基酸含量提高了9.021 mg/g，其中提高最多的是天冬氨酸，含量高達(dá)22.536 mg/g。天冬氨酸大量存在于生物合成作用中，它是生物體內(nèi)多種人體必需氨基酸的合成前體。其中，8種人體必需氨基酸除色氨酸外，其余氨基酸含量較游離氨基酸都明顯升高，苯丙氨酸含量達(dá)3.416 mg/g。苯丙氨酸作為人體必需氨基酸在人體內(nèi)不能合成，只能靠植物和微生物合成，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和化工行業(yè)[9]。半必需氨基酸中精氨酸、組氨酸含量分別為16.274、0.704 mg/g。臨床研究證明，精氨酸有促進(jìn)傷口愈合、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抗腫瘤等方面的作用[10-13]，臨床應(yīng)用與冠心病、心衰和高血壓等疾病[14]。在酸水解過(guò)程中有3種氨基酸在水解后含量減少，原因可能是色氨酸結(jié)構(gòu)被破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺發(fā)生脫酰胺基反應(yīng)，這也是本方法需要進(jìn)一步完善的原因。

綜上所述，本文建立了異氰酸苯酯（PITC）柱前衍生同時(shí)HPLC法分離并測(cè)定仙鶴草中游離氨基酸及水解氨基酸的分析方法。該方法簡(jiǎn)便、快捷、高效，具有較高的穩(wěn)定性，可用于工業(yè)生產(chǎn)，為仙鶴草中蛋白質(zhì)及氨基酸資源的深入開發(fā)提供了理論參考。

圖1　仙鶴草氨基酸高效液相色譜圖Fig.1　Agrimonia pilosa Ledeb.amino acid HPLC

[1]裴月湖,李銑,朱延儒,等.仙鶴草根芽中新二氫黃酮醇苷的結(jié)構(gòu)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1990,25(4):267-270

[2] 李霞,葉敏,余修祥,等.仙鶴草化學(xué)成分的研究[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1995,27(1):60-61

[3] 巴曉雨,何永志,路芳,等.仙鶴草研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,13(5):258-260

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2010:76

[5]杜雪莉,張鳳枰,劉耀敏.微波輔助蛋白質(zhì)水解效果穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2011,32(8):121

[6]章麗,劉松雁.氨基酸測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].河北化工,2009,32 (5):27-29

[7]馬爽,趙巖,趙曉紅,等.柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定黃芩中氨基酸含量[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(5):113-116

[8]趙巖,唐國(guó)勝,侯瑩瑩,等.柱前衍生RP-HPLC測(cè)定楊樹花中氨基酸含量[J].食品安全檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,5(7):2192-2197

[9] 李冀新,張超.L-苯丙氨酸生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].氨基酸和生物資源,2006,28(2):51-56

[10]單永紅,劉炳成.精氨酸一種多功能的生化藥物[J].中國(guó)生物化學(xué)雜志,2001,22(6):265-266

[11]陳冠容,主編.老藥新用[M],北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:639-648

[12]彭曦,尤忠義,汪仕良.精氨酸對(duì)機(jī)體免疫功能的影響及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志,2005,13(6):388-390

[13]陳直軍,齊玉梅.精氨酸免疫營(yíng)養(yǎng)作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志,2007,15(5):125

[14]劉耀.精氨酸在臨床上的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2014, 25(10):1422-1423

Content Determination of Amino Acid in Agrimonia pilosa Ledeb.by Precolumn Derivatization RPHPLC

ZHAO Yan1，ZHAO Tian-qi1，XU Dian-wen2，GAO Yu-gang1，CAIEn-bo1，LIU Shuang-li1，YANG He1，ZHANG Lian-xue1，*
（1.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.Shenyang Military Taonan Training Field，Baicheng 137100，Jilin，China）

To determine the content amino acid in Agrimonia pilosa Ledeb.by pre-column derivatization RPHPLC.The samples were derived with phenylisothiocy anate（PITC）.The column was Ultimate Amino Acid of specific column（4.6 mm×250 mm，5μm）；Mobile phase：A was mixture ofacetonitrile-water（80%，volume fraction），B was a buffer solution ofCH3COONa（pH6.5）-acetonitrile（7%，volume fraction），eluting with a gradi ent.UV wavelength was setat254 nm.The linearrange of21 amino acids was 0.001 9μmol/mL-2.700 0μmol/mL （R2>0.999 0）；the average recovery rates of21 free amino were ranged from 95.84%to 111.34%（RSD=1.23%-2.54%，n=6），the average recovery ofrates of21 totalamino acids was ranged from 90.79%to 111.23%（RSD= 1.29%-2.21%，n=6）.This method was flexible，accurate and repeatable and stable for the determination of amino acids in Agrimonia pilosa Ledeb..

Agrimonia pilosa Ledeb.；precolumn derivatization；amino acid；high performance liquid chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.027

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI03B01）；國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201303111）；科技部科技人員服務(wù)企業(yè)項(xiàng)目（2009GJB10031）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130303094；20140204013YY；YYZX201258；20140311050YY）

趙巖（1979—），男（滿），副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：天然藥物化學(xué)成分與生物活性。

張連學(xué)（1955—），男，教授，博士，研究方向：藥用植物栽培與加工。

2015-04-11