趙志剛，宣麗英，李志英，高瑞苑，張海容（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取夏枯草多糖工藝

趙志剛，宣麗英，李志英，高瑞苑，張海容*
（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取夏枯草中多糖類化合物的工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇提取功率、提取溫度、提取時間、液固比和提取次數(shù)5個因素，利用Box-Benhnken中心組合試驗和響應(yīng)面分析法，研究了各自變量交互作用及其對夏枯草多糖產(chǎn)率的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)果表明：夏枯草中多糖類化合物的最佳超聲輔助提取工藝為：提取功率90 W、提取溫度65℃、液固比40∶1（mL/g）、時間52 min、提取次數(shù)兩次，夏枯草中多糖類的實測結(jié)果（4.60%）與響應(yīng)面擬合方程的預(yù)測值（4.64%）符合良好。

夏枯草；響應(yīng)面法；多糖；超聲輔助提取

夏枯草（Prunella vugaris L.）為唇形科夏枯草屬植物，多年生草本，為常用中藥。主要生長于疏林、荒山、田埂及路旁，花期4月～6月，果期7月～10月。由于此草夏至后即枯，故有此名，主產(chǎn)于江蘇、安徽、浙江、河南等省。夏枯草性寒，味甘、辛、微苦，具有清泄肝火、明目、清熱解毒、祛痰止咳、涼血止血、利尿的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，夏枯草有降低血壓的作用。夏枯草的干燥果穗和全草均可入藥也可制作美味佳肴[1-3]。夏枯草含有多種活性化學(xué)成分，其中多糖具有抗菌、降壓、消炎、抗腫瘤、降血糖等獨(dú)特的藥理功能[4-6]，在臨床方面具有獨(dú)特的應(yīng)用前景。

文獻(xiàn)中關(guān)于夏枯草的藥理研究、栽培、化學(xué)成分、產(chǎn)品開發(fā)等及夏枯草中多糖的提取技術(shù)已有不少報道，但有關(guān)響應(yīng)面優(yōu)化-超聲輔助提取夏枯草中多糖的技術(shù)鮮見報道。多糖是夏枯草中的重要活性成分，本試驗針對夏枯草多糖具有抗腫瘤、抗病毒等藥理作用，研究夏枯草中多糖的提取方法，應(yīng)用硫酸-苯酚法測定夏枯草中多糖的含量，為夏枯草的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1　儀器與材料

1.1材料及試劑

夏枯草：產(chǎn)地江蘇，購自忻州市老藥工藥店，恒溫50℃烘干，粉碎過60目篩，保存?zhèn)溆?；葡萄糖（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；苯酚（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃硫酸（98%）：天津市耀華化學(xué)試劑有限公司。

1.2試驗儀器

Al204型電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200DV型數(shù)控超聲波清洗器：超聲功率150 W，超聲頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司；723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司。

2　方法

2.1工作曲線和回歸方程

用移液管分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于9支比色管中，用二次蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，加5%的苯酚溶液各1 mL，再加98%的濃硫酸各5 mL，靜置0.5 h、冷卻至室溫，在最大吸收波長490 nm處，以試劑空白為參比，測定吸光度值，并以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C （μg/mL）為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A= 0.047 6C-0.023 3，R2=0.996 8。

2.2樣品中多糖化合物含量的測定

準(zhǔn)確稱取樣品0.200 0 g于試管中，超聲提取后，抽濾，定容至100 mL容量瓶中，搖勻。移取25 mL于50 mL的容量瓶中進(jìn)行稀釋2倍，然后從50 mL容量瓶中移夏枯草中多糖類化合物的產(chǎn)率。

多糖產(chǎn)率/%=C×D×f÷W×100

式中：C為供試液中葡萄糖濃度，mg/mL；D為多糖的稀釋因素，mL；f為換算因子；W為供試夏枯草樣品的重量，mg。

2.3響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計原理，4個主要因素超聲功率、超聲溫度、液固比和超聲時間分別用A、B、C、D、來表示，每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、+1進(jìn)行編碼。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1　試驗因素水平及編碼Table 1　Experimentalfactors leveland coding

3　結(jié)果與分析

3.1單因素試驗

3.1.1超聲功率對多糖產(chǎn)率的影響

在提取溫度為65℃，提取時間為30 min，液固比為40∶1（mL/g），研究超聲波功率在60 W～150 W時對多糖產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　超聲功率對多糖產(chǎn)率的影響Fig.1　The influence of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide

由圖1可知隨超聲波功率的增加，產(chǎn)率提高，直到超聲波功率達(dá)到90 W時，產(chǎn)率達(dá)到最大，再增加超聲功率，產(chǎn)率反而會有所下降，最后達(dá)到穩(wěn)定。因此，從節(jié)能的角度考慮，在響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗中，選90 W左右為最佳。

3.1.2超聲溫度對多糖產(chǎn)率的影響

提取功率為90 W，提取時間為30 min，液固比為40∶1（mL/g），研究超聲溫度對產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　超聲溫度對多糖產(chǎn)率的影響Fig.2　The influence of ultrasonic temperature on extraction yield ofpolysaccharide

由圖2可知，隨著溫度的升高產(chǎn)率增大，直至達(dá)到穩(wěn)定。當(dāng)溫度為65℃時，多糖的產(chǎn)率最大。所以選65℃左右為最佳。

3.1.3液固比對多糖產(chǎn)率的影響

提取溫度為65℃，提取時間為30 min，超聲波功率為90 W，研究液固對多糖產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知隨著液固比的增加，多糖的產(chǎn)率逐漸增加，當(dāng)達(dá)到40∶1（mL/g）時，多糖的產(chǎn)率達(dá)到最大，再增加液固比多糖產(chǎn)率下降，因此選用40∶1（mL/g）左右最佳。

圖3　液固比對多糖產(chǎn)率的影響Fig.3　The influence ofliquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharide

3.1.4超聲時間對多糖產(chǎn)率的影響

提取溫度為65℃，液固比為40∶1（mL/g），超聲波功率為90 W，研究提取時間對多糖產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　超聲時間對多糖產(chǎn)率的影響Fig.4　The influence of ultrasonic time on extraction yield of polysaccharide

由圖4可知，隨著提取時間的增加，產(chǎn)率逐漸提高，直到50 min達(dá)到最高值。因此選取超聲時間為50 min左右為宜。

3.1.5提取次數(shù)對多糖產(chǎn)率的影響

提取次數(shù)對多糖產(chǎn)率的影響見圖5。

圖5　提取次數(shù)對多糖產(chǎn)率的影響Fig.5　The influence of extraction times on extraction yield of polysaccharide

由圖5可知，提取第一次的多糖產(chǎn)率為4.36%，提取第二次的多糖產(chǎn)率為1.28%，提取第三次的多糖產(chǎn)率為0.48%，比較3次提取發(fā)現(xiàn)第二次提取占第一次的29%，而第三次提取占第一次的11%，考慮到增加提取次數(shù)，會增加生產(chǎn)成本，選取提取2次。

3.2提取工藝條件響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗

以A=（a-90）/30，B=（b-65）/10，C=（c-40）/10，D=（d-50）/10為自變量，以多糖化合物產(chǎn)率為響應(yīng)值（P），進(jìn)行響應(yīng)曲面分析試驗。響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken中心組合設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2　Box-Behnken experimentdesign and the results of these experiments

用Design Expert7.0.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到多糖化合物產(chǎn)率與各因素變量的二次多項回歸方程模型：對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，本試驗所選模型不同處理間差異及（P=0.000 2<0.05），R2=0.892 4和Adeq Precisior（信噪比）等于9.024，遠(yuǎn)大于4，說明回歸方程的擬合度和可信度均較高[7]。模型響應(yīng)值的變異系數(shù)CV值為4.36%小于5%，表明試驗操作是可信的。從回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果可知，模型的一次項D是顯著的，二次項A2、B2、C2、D2都是顯著的，交互項AB是顯著的。說明各因素對多糖化合物產(chǎn)率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3　回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗Table 3　Analysis of asriances and significance test of coefficients for the created regression model

3.2.1響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖分析見圖6～圖11。

圖6　超聲功率與超聲溫度對多糖產(chǎn)率的影響Fig.6　The influence of Ultrasonic power and ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharide

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖如圖6～圖11所示。由圖可見，6個響應(yīng)曲面均均呈現(xiàn)凸球形曲面，說明兩因素間交互作用非常顯著。同時，其投影等高線最小橢圓的中心全部落在所選的-1～1范圍內(nèi)，響應(yīng)值（夏枯草多糖）在4個因子設(shè)計的范圍內(nèi)呈現(xiàn)極大值。

圖7　超聲功率與液固比對多糖產(chǎn)率的影響Fig.7　The influence of ultrasonic power and liquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharide

圖8　超聲時間和超聲功率對多糖產(chǎn)率的影響Fig.8　The influence of ultrasonic time and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide

圖9　液固比和超聲溫度對多糖產(chǎn)率的影響Fig.9　The influence of Liquid-solid ratio and temperature on extraction yield of polysaccharide

圖10　超聲時間和超聲溫度對多糖產(chǎn)率的影響Fig.10　The influence of ultrasonic time and temperature onextraction yield ofpolysaccharide

圖11　超聲時間和液固比對多糖產(chǎn)率的影響Fig.11　The influence of ultrasonic time and solid-liquid ratio on extraction yield ofpolysaccharide

3.2.2最優(yōu)工藝條件驗證

P=1.15+0.024A+0.017B+0.018C+0.033D-0.052AB-0.038AC-7.500×10-3AD-2.500×10-3BC+ 0.020BD-0.057A2-0.089B2-0.15C2-0.07D2

求解方程組得：A=0.070 3；B=-0.009 8；C=0.051 2；D=0.209 6。即超聲功率為92.11 W、超聲溫度為64.90℃、液固比為40.51∶1（mL/g）、超聲時間為52.10 min，此時多糖產(chǎn)率理論值可達(dá)到4.64%。在試驗條件允許的條件下選取超聲功率為90 W，超聲溫度為65℃、液固比為40∶1（mL/g）、超聲時間為52 min，驗證試驗表明，產(chǎn)率為4.60%，與理論值相符較好。因此，采用響應(yīng)面法得到的提取條件參數(shù)相對可靠，具有使用價值。

3.2.3超聲輔助提取法與常規(guī)溶劑提取法的對比試驗

準(zhǔn)確稱取10.00 g的夏枯草粉末，按40∶1（mL/g）的液固比加400 mL二次蒸餾水于1 000 mL大燒杯中進(jìn)行溶解后，在80℃的恒溫水浴鍋中加熱8 h，然后抽濾，收集濾液，將濾渣重新用400 mL二次蒸餾水進(jìn)行溶解后，與第一次同樣的溫度下再次恒溫加熱8 h，然后抽濾，收集濾液。將兩次收集的濾液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉其中的部分水分，將剩余的濾液定容到250 mL的容量瓶中。稀釋40倍，進(jìn)行吸光度的測定。根據(jù)2.2中計算多糖產(chǎn)率的公式進(jìn)行計算，得到多糖的產(chǎn)率為4.16%。試驗結(jié)果見圖12。

由圖12可看出，同樣的液固比條件下，超聲輔助提取夏枯草中的多糖化合物，其產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)溶劑提取法。原因是超聲波的空化效應(yīng)使得夏枯草細(xì)胞被均勻破壞，多糖化合物較易溶出，而常規(guī)溶劑提取法盡管提取時間很長（16 h），但細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有遭到破壞，多糖化合物傳質(zhì)阻力較大，從而產(chǎn)率較低。

圖12　超聲提取法與常規(guī)溶劑提取法的對比實驗結(jié)果Fig.12　Comparison of ultrasonic and conventional solvent extraction technology

4　結(jié)論

利用由響應(yīng)面法得到的模型進(jìn)行探討，得到夏枯草中多糖化合物的超聲輔助提取過程優(yōu)化的工藝條件：超聲功率為90 W、超聲溫度為65℃、液固比為40∶1（mL/g）、超聲時間為52 min、超聲提取次數(shù)為兩次，此時多糖產(chǎn)率可達(dá)4.6%。因此，采用響應(yīng)面法獲得的夏枯草中多糖化合物的超聲輔助提取工藝條件，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，科學(xué)可行。超聲輔助提取法與常規(guī)溶劑提取法的對比試驗結(jié)果表明，采用超聲輔助提取工藝提取夏枯草中的多糖化合物，產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)溶劑提取工藝。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Polysaccharide from
Prunella vulgaris L.by Response Surface Methodology

ZHAO Zhi-gang，XUAN Li-ying，LIZhi-ying，GAO Rui-yuan，ZHANG Hai-rong*
（Lab of BiochemicalAnalysis，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharide of Prunella vulgaris L.was studied. Based on the experiment of single factor，the mathematical regression model was established about the dependentvariable（extraction yield ofpolysaccharide）and independent variables（extraction power，extraction temperature，extraction time，ratio of liquid to soild，extraction times）though Box-Benhnken center composite design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction condition were as follow：extracting power of 90 W，extracting temperature was 65℃，the ratio of liquid to solid was 40∶1（mL/g），extracting time of52 min，and extraction times of2.Under these conditions，the practicalyield ofpolysaccharide of Prunella vulgaris L.was 4.60%，which was consistentwith the predicted yield ofpolysaccharide of4.64%.

Prunella vulgaris L.；response surface methodology；polysaccharide；ultrasonic-assisted extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.021

忻州師范學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目資助計劃（xk201402）；山西省高等學(xué)校教學(xué)改革項目（2015-100）；山西省教育廳重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項目（20141010）

趙志剛（1964—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：天然植物分離及分析。

張海容（1957—），男（漢），教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：有機(jī)分析。

2015-05-19