何春霞，姚新成，曹文堯（.新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院石油與化學(xué)工程系，新疆奎屯83300；.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子83000）

響應(yīng)面法優(yōu)化提取大葉補(bǔ)血草根莖中總黃酮工藝條件

何春霞1，姚新成2，曹文堯1
（1.新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院石油與化學(xué)工程系，新疆奎屯833200；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取新疆大葉補(bǔ)血草根莖中總黃酮的工藝條件。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法分析（Response surface analysis methodology，RSM）對大葉補(bǔ)血草根莖中總黃酮的超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立回歸模型。結(jié)果表明，經(jīng)RSM數(shù)據(jù)處理獲得提取最優(yōu)條件為：超聲30 min，液料比17∶1（mL/g），乙醇濃度為65%，總黃酮得率預(yù)測值為2.15%。在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮的平均得率為2.45%，與理論值的相對誤差為0.6%，理論值與試驗(yàn)值相吻合。在最佳提取條件下，可從新疆大葉補(bǔ)血草根莖中獲得質(zhì)量穩(wěn)定、含量較高的總黃酮提取物。

大葉補(bǔ)血草；總黃酮；響應(yīng)面法；超聲波提取法

大葉補(bǔ)血草（Limonium gmelinii（Wiid）Kuntze）屬藍(lán)雪科（Plumbaginaceae）補(bǔ)血草屬植物，又名大葉磯松《新疆中草藥手冊》、西伯利亞補(bǔ)血草《新華本草綱要》，是多年生草本耐鹽旱中生植物，主要分布在新疆北部[1]。大葉補(bǔ)血草的根莖是維吾爾族和哈薩克族的傳統(tǒng)用藥，全草和根富含各種黃酮類化合物：楊梅素及其苷類、異鼠李素、槲皮素、四羥基黃酮、花色素醇、飛燕草素醇等[2]，具有抗菌消炎、止血散瘀的功效，主要用于一些婦科疾病，比如：子宮內(nèi)膜炎、宮頸糜爛、子宮出血的治療，維吾爾族和哈薩克族民間還流傳有其治療婦科疾病的多種附方[3]。目前，在國內(nèi)筆者少見對大葉補(bǔ)血草的化學(xué)成分和藥理學(xué)作用研究的文獻(xiàn)和報(bào)道，而國外對大葉補(bǔ)血草的相關(guān)研究多圍繞其含有的黃酮類物質(zhì)成分進(jìn)行[4-5]。

對天然植物中總黃酮的提取方法及提取工藝優(yōu)化方法均比較多。其中超聲波提取法由于超聲波能增大物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑的穿透力，提高藥物溶出速度和溶出次數(shù)，縮短提取時(shí)間，具有省時(shí)、節(jié)能、提取率高的優(yōu)勢[6]；響應(yīng)面法（Response surface analysis methodology，RSM）是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的一種統(tǒng)計(jì)方法[7]，RSM不僅考慮了試驗(yàn)隨機(jī)誤差，還將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的一次或二次多項(xiàng)式模型來擬合，計(jì)算更為簡便。本著方便、快捷，本試驗(yàn)采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)模型，使用響應(yīng)面法對大葉補(bǔ)血草總黃酮的超聲波提取條件進(jìn)行全面的優(yōu)化，為提高大葉補(bǔ)血草根莖中總黃酮得率，以及更好地開發(fā)和利用大葉補(bǔ)血草提供合理的參考。

1　材料和方法

1.1儀器及材料

UV-2401紫外分光光度儀：日本島津公司；BP211D十萬分之一電子分析天平：德國Sartorius；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；RE-201D恒溫水油浴鍋：上海普渡生化科技有限公司；TP300超聲波提取器：天鵬電子新技術(shù)（北京）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000：上海亞榮生化儀器廠。

大葉補(bǔ)血草原料：采摘于新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系郭潤華教授鑒定為藍(lán)雪科補(bǔ)血草屬植物大葉補(bǔ)血草的干燥根莖；槲皮素（批號：100081-200406）對照品：中國藥品生物制品檢定所（供含量測定用）；其它試劑均為分析純。

1.2總黃酮的測定

對照溶液的制備：精密稱取槲皮素對照品10.75 mg，置50 mL容量瓶中，加95%甲醇適量，超聲處理時(shí)溶解，放冷，加95%甲醇至刻度，搖勻即得。（每1 mL中含槲皮素0.215 mg）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液0.02、0.10、0.20、0.30、0.40 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，各加適量甲醇，加10%AlCl3溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min，加5%KAc溶液2.50 mL，加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，以空白甲醇加入相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見分光光度測定方法，于λ=436 nm的波長處測定吸光度A。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)方程A=0.082 9C+ 0.041 2（R2=0.987 4，濃度范圍3μg/mL～11μg/mL）。1.3樣品的制備與樣品中總黃酮的測定

稱取大葉補(bǔ)血草20 g，粉碎，加入400 mL 70%乙醇溶液，超聲25 min，抽濾，得濾液。精密移取濾液200μL 于10 mL容量瓶中，加入甲醇0.8 mL，再加入10% AlCl3溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min，再加入5%KAc溶液2.50 mL，最后甲醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，以空白甲醇加入相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見分光光度測定λ=436 nm的波長處測定吸光度值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品濃度。并按下面公式計(jì)算總黃酮得率Y。

式中：Y為總黃酮的得率，%；C為樣品濃度，mg/ mL；V為濾液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為稱取的大葉補(bǔ)血草的質(zhì)量，g。

1.4單因素試驗(yàn)對大葉補(bǔ)血草總黃酮提取條件的優(yōu)化

1.4.1超聲時(shí)間對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響

按照1.3的方法，固定70%乙醇溶液，液料比10∶1（mL/g），考察超聲時(shí)間分別為15、20、25、30、35 min時(shí)對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響。

1.4.2液料比對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響

按照1.3的方法，采用1.4.1的優(yōu)化結(jié)果，同時(shí)固定乙醇濃度（70%），考察液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）時(shí)對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響。

1.4.3乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響

按照1.3的方法，采用以前兩個(gè)優(yōu)化條件的結(jié)果為提取條件，考察乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響。

1.5響應(yīng)面法優(yōu)化大葉補(bǔ)血草中總黃酮的超聲波法提取條件

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)，因素水平表見表1。

表1　Box-Behnken的中心組合因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken centralcomponent experiments design

采用響應(yīng)面法分析超聲時(shí)間、料液比和乙醇濃度對響應(yīng)值的影響，同時(shí)優(yōu)化大葉補(bǔ)血草總黃酮的超聲波提取條件。

2　結(jié)果與討論

2.1超聲波提取過程的單因素試驗(yàn)

2.1.1提取時(shí)間對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響

超聲波提取時(shí)間對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1　提取時(shí)間對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of the extraction time on the yield oftotalflavonoids

由圖1可以看出，隨著時(shí)間的增長，總黃酮得率不斷升高，提取時(shí)間約25 min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高點(diǎn)；隨著時(shí)間延長，總黃酮得率反而有下降的趨勢?？赡苁怯捎诔晻r(shí)間過長對黃酮有分解作用，同時(shí)也增加物質(zhì)溶出所致，因此選擇提取時(shí)間為25 min。

2.1.2液料比對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響

液料比對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響結(jié)果見圖2。

圖2　液料比對大葉補(bǔ)血草總黃酮提取率的影響Fig.2　Effect ofratio ofsolventto materialon the yield oftotal flavonoids

由圖2可以看出，液料比從15∶1（mL/g）增加到25∶1（mL/g）的過程中，總黃酮的得率迅速升高；當(dāng)液料比（體積∶質(zhì)量）達(dá)到約25∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮的得率達(dá)到最大，之后略有下降，但幅度很小，為了節(jié)約原材料，液料比宜選取25∶1（mL/g）。

2.1.3提取溶劑中乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響

提取溶劑中乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3　乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草得率的影響Fig.3　Effectof the concentration of ethanolon the yield of total flavonoids

由圖3可以看出，乙醇濃度為50%～63%時(shí)，總黃酮的得率逐漸升高；當(dāng)乙醇濃度為63%～90%時(shí)，總黃酮的得率有明顯的下降，出現(xiàn)這種情況的原因可能是因?yàn)殡S乙醇濃度的升高，溶液極性減弱，可溶性黃酮成分含量減少所致。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化大葉補(bǔ)血草中總黃酮的超聲波提取法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并采用Design-expert程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)（以A=（Z1-25）/5，B=（Z2-20）/5，C=（Z3-60）/10為自變量，以大葉補(bǔ)血草總黃酮得率Y為響應(yīng)值），設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Box-Behnken Experiments design and the results of experiments

表2中試驗(yàn)1、5、9、12、13為中心試驗(yàn)，其余試驗(yàn)為析因試驗(yàn)。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為為自變量取值在A、B和C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。同時(shí)通過擬合得到響應(yīng)面的二次方程為：

響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3　The results of statisticalanalysis of RSM

用F檢驗(yàn)來判定各變量值影響的顯著作用，若P< 0.001時(shí)影響為極顯著，P<0.01時(shí)影響為高度顯著，P< 0.05時(shí)影響顯著。結(jié)果顯示，模型回歸P（Pr>F）為0.025 1，說明模型回歸顯著可靠，B（液料比）和C（乙醇濃度）的交互作用對大葉補(bǔ)血草總黃酮的得率影響顯著（P<0.05），同時(shí)B（液料比）的平方項(xiàng)和C（乙醇濃度）的平方項(xiàng)對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響有高度的顯著性，說明液料比和乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草總黃酮的影響不是簡單的線性關(guān)系，這與模型分析的結(jié)果相同。模型方差分析結(jié)果表明，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（r=0.861 0）說明模型能解釋86.10%的響應(yīng)值變化。

為考察交互項(xiàng)對提取率的影響，其他因素固定在零水平，選取兩個(gè)交互的因素對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率進(jìn)行響應(yīng)面圖分析，如圖4～圖6所示。

結(jié)果表明，曲面上相同提取率對應(yīng)的因素值在底面上形成的曲線為等高線，等高線的形狀反映了交互作用的強(qiáng)弱。當(dāng)?shù)雀呔€接近于圓形時(shí)，兩因素的交互作用弱；當(dāng)?shù)雀呔€呈現(xiàn)橢圓形時(shí)，兩因素的交互作用強(qiáng)。存在極值的條件應(yīng)該在等高線圖的圓心處。從三組圖可以看出，時(shí)間和液料比的交互作用最顯著，料液比對總黃酮提取率的影響最顯著，表現(xiàn)為其曲線較陡。三組圖的曲面中心頂點(diǎn)均接近于各因素的零水平，說明提取率的最優(yōu)工藝應(yīng)在各因素的零水平左右。

圖4　提取時(shí)間和液料比對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響Fig.4　Effectofextraction time and ratio ofsolvent to materialon flavonoid extraction rate

圖5　提取時(shí)間和乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響Fig.5　Effect ofextraction time and concentration ofethanolon flavonoid extraction rate

圖6　液料比和乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草總黃酮得率的影響Fig.6　Effects ofratio of solvent to materialand concentration of ethanolon flavonoid extraction rate

通過相應(yīng)面優(yōu)化，得到試驗(yàn)的最佳提取條件為：提取時(shí)間28.99 min，液料比17.26∶1（mL/g），乙醇濃度65.2%，預(yù)測總黃酮的得率達(dá)到2.15%。為了方便試驗(yàn)，將試驗(yàn)條件簡化為：提取時(shí)間30 min，液料比17∶ 1（mL/g），乙醇濃度65%。

3　結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)考察了提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度對大葉補(bǔ)血草根莖中總黃酮提取率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了回歸數(shù)學(xué)模型，得到最佳提取工藝為：提取時(shí)間30 min，液料比17∶1（mL/g），乙醇濃度65%。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下總黃酮的提取率達(dá)到2.45%，與預(yù)測值相符，優(yōu)化效果明顯。本優(yōu)化條件結(jié)果為獲取較高含量的大葉補(bǔ)血草總黃酮，更好地利用植物資源提供合理的參考。

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The Study on Response Surface Method to Optimize the Extracted and Purified Process of Total Flavonoids from Limonium gmelinii

HE Chun-xia1，YAO Xin-cheng2，CAO Wen-yao1
（1.Department of Petroleum and Chemical Engineering，Xinjiang Applied Vocational Technical College，Kuitun 833200，Xinjiang，China；2.College ofPharmacy，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China）

Response surface method was applied to optimize the ultrasonic extraction conditions for preparing totalflavonoids from Limonium gmelinii（Wiid）Kuntze.The influence factors ofultrasonic extraction were evaluated using the Box-Behnken central component experiments and analyzed by RSM.The optimum extraction conditions were confirmed as follows：extraction time of 30 min，ratio ofliquid to solid 17∶1（mL/g），concentration ofethanol65%.The predicted yield of generalflavonoids was 2.15%.Validation experiments were carried out three times at the optimal conditions，the average yield of general flavonoids was 2.45%.The relative error between actualvalues and predicted values is 0.6%.Itfitwellthe predicted values.The developed regression equation can be wellfitted with experimentalresults and used for actualprediction，and italso provided reference for the extraction oftotalflavonoids from L.gmelini i.

Limonium gmelinii；totalflavonoids；response surface optimization method；ultrasonic extraction

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（201318101-18）

何春霞（1981—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：生物化學(xué)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.013

2015-05-12