尤秀麗，鄭建忠，陳熔，蔡曉丹，李瓊，譚昌會（.閩南師范大學化學與環(huán)境學院，福建漳州363000；2.福建省現(xiàn)代分離分析科學與技術(shù)重點實驗室，福建漳州363000）

響應(yīng)面法優(yōu)化絞股藍皂苷微波輔助-超聲提取工藝

尤秀麗1，2，鄭建忠1，2，陳熔1，蔡曉丹1，李瓊1，譚昌會1，2
（1.閩南師范大學化學與環(huán)境學院，福建漳州363000；2.福建省現(xiàn)代分離分析科學與技術(shù)重點實驗室，福建漳州363000）

以絞股藍為原料，采用微波超聲雙輔助提取皂苷。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，建立二次多項數(shù)學模型。結(jié)果表明，絞股藍皂苷微波超聲雙輔助提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：微波功率400 W、超聲時間60 min、乙醇濃度80%、超聲溫度為51℃、微波時間117 s、液料比28∶1（mL/g），此條件下絞股藍皂苷提取率為7.05%，與預(yù)測值的相對誤差約為0.57%，試驗值與預(yù)測值相吻合。

響應(yīng)面法；微波超聲雙輔助提取；絞股藍；皂苷

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）又名七葉膽，甘茶蔓，為葫蘆科絞股藍屬多年生落葉草質(zhì)藤本植物，素有“南方人參”和“第二人參”之美稱[1]。絞股藍主要分布在我國秦嶺至淮河線以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)[2]，2002年國家衛(wèi)生部將其列為新資源藥食兩用，并將其列入保健品名單[3-4]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，絞股藍皂甙（gypenosides，GPS）是絞股藍的主要有效成分，其中絞股藍皂甙Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅻ分別與人參皂甙Rbl、Rb3、Rd和F2是同一物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用，一直是絞股藍研究的熱點[5-7]。

近年來，絞股藍皂苷提取工藝有很多，如水浴法[8]、醇提法[9-11]、微波法[12-13]、酶提法[14]、超聲波[15-16]等方法。超聲波和微波提取技術(shù)又是天然產(chǎn)物提取中的新型技術(shù)[17-20]，具有設(shè)備簡單、操作快捷、適用范圍廣、提取率高、溶劑用量少、節(jié)時、節(jié)能、安全污染小等優(yōu)點。目前鮮見使用響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲雙輔助技術(shù)提取絞股藍皂苷的相關(guān)報道。本文利用響應(yīng)面法對微波-超聲雙輔助提取絞股藍皂苷進行優(yōu)化，采用回歸分析得到絞股藍皂苷最佳工藝條件，為絞股藍皂苷的開發(fā)應(yīng)用研究提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絞股藍，購于漳州紫金藥店；人參皂苷Rb1（>98% HPLC）分析標準品，上海純優(yōu)生物科技有限公司；無水乙醇、無水甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸，均為分析純。

XFB-200藥材粉碎機：吉首市中湘制藥機械廠；UV-1800 PC紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；P70D20TP-C6（WO）微波爐：廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；BS110S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；WH-200超聲波清洗機：濟寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司。

1.2標準曲線的制備

精確稱取人參皂苷Rb1對照品5.0 mg，用甲醇定容至5 mL，制成濃度為1.0 mg/mL的儲備液。精密量取儲備液20、40、60、80、100、120μL分別置于具塞試管中，水浴中去除甲醇，加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，混勻后，密置于水浴中加熱，取出、冷卻，加入5 mL冰醋酸，相應(yīng)試劑為空白。在550 nm下測定吸光度，以人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y= 21.349x-0.034 4，R2=0.999 2。

1.3微波超聲提取絞股藍皂苷

將所購的絞股藍置于60℃恒溫干燥箱中，待烘干后，用藥材粉碎機粉碎，過80目篩，得絞股藍粉末。稱取絞股藍粉末1.000 0 g，置于微波容器內(nèi)，然后設(shè)定一定的微波功率、微波時間，處理后，再加入一定量乙醇溶液作溶劑，置于超聲波器中，在一定的超聲溫度、超聲時間、液料比提取。后冷卻后過濾提取液，量其體積。取20μL提取液于具塞試管，用85℃水浴揮干提取液，采用香草醛-高氯酸比色法在波長550 nm下測其吸光度，然后由標準曲線計算出待測樣品的絞股藍皂苷提取率。

式中：C為皂苷的濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為絞股藍的質(zhì)量，g。

1.4單因素試驗設(shè)計

以皂苷提取率為指標，準確稱取絞股藍粉末1.000 0 g，選取微波時間、微波功率、料液比、超聲時間、超聲溫度和乙醇濃度作為影響絞股藍皂苷微波超聲雙輔助提取的單因素，每組試驗重復3次，取其平均值。

1.5響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇影響絞股藍皂苷提取率的3個主要影響因素：微波時間、料液比和超聲溫度進行響應(yīng)面組合試驗，試驗自變量因素編碼及水平設(shè)計見表1。

表1　Box-Behnken試驗自變量因素水平表Table 1　Variables and levels for the Box-Behnken experimental design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1微波時間對絞股藍皂苷提取率的影響

當微波功率400 W，乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，超聲時間60 min，液料比10∶1（mL/g），考察微波時間30、60、90、120、150 s對皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖1。

圖1　微波時間對皂苷提取率的影響Fig.1　Effect of microwave time on the extraction yield ofsaponins

由圖1可知，隨著微波時間加長，皂苷提取率隨之升高，當微波時間大于120 s后，提取率反而下降，可能是因為微波時間加長，有效成分受到破壞，至使提取率下降，因此，微波時間120 s較為適合。

2.1.2微波功率對絞股藍皂苷提取率的影響

當微波時間120 s，乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，超聲時間60 min，液料比10∶1（mL/g），考察微波功率100、150、400、550、700 W對皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著微波功率從100 W增加到400 W，皂苷的提取率增加幅度較大，這可能是因為隨著微波功率的增大，強大的內(nèi)壓及分子間的摩擦力使絞股藍細胞破裂，皂苷溶解速度加快，提取率升高；微波功率過大，溫度較高，皂苷有效成分易被氧化降解，從而使提取率下降。因此，試驗選取較優(yōu)微波功率為400 W。

圖2　微波功率對皂苷提取率的影響Fig.2　Effect ofmicrowave power on the extraction yield of saponins

2.1.3液料比對絞股藍皂苷提取率的影響

當微波功率400 W，微波時間120 s，乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，超聲時間60 min，考察液料比10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（mL/g）對皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3　液料比對皂苷提取率的影響Fig.3　Effectofolid-to-solventratio on the extraction yield of saponins

由圖3可以看出，隨著液料比增加，皂苷的提取率也隨之增大，當液料比大于25∶1（mL/g）時，提取率反而下降，這可能是因為當料液比達到一定的比例，目標成分已提取充分，料液比若繼續(xù)升高，則對提取率的影響不大，而且溶劑量過大會增加成本及后續(xù)液體濃縮的難度，因此，試驗選取液料比25∶1（mL/g）較為適合。

2.1.4超聲時間對絞股藍皂苷提取率的影響

當微波功率400 W，微波時間120 s，液料比25∶1（mL/g），乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，考察超聲時間30、45、60、75、90 min對皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著超聲時間的延長，皂苷提取率也隨之升高，當超聲時間大于60 min后，提取率反而下降，這可能是因為長時間的提取會使皂苷部分降解，因此，選取最佳超聲時間為60 min。

圖4　超聲時間對皂苷提取率的影響Fig.4　Effectofultrasonic treatmenttime on the extraction yield of saponins

2.1.5超聲溫度對絞股藍皂苷提取率的影響

當微波功率400 W，微波時間120 s，超聲時間60 min，液料比25∶1（mL/g），乙醇濃度80%，考察超聲溫度40、50、60、70℃對皂苷提取率的影響。試驗結(jié)果見圖5。

圖5　超聲溫度對皂苷提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasonic treatment temperature on the extraction yield of saponins

從圖5可見，絞股藍皂苷隨溫度的升高而提取率增大，當超聲溫度為50℃時，絞股藍總皂苷的提取率達到最大值；提取溫度大于50℃后，絞股藍皂苷的提取率開始下降。其原因是隨著溫度升高，加快分子運動速度，從而使溶出物增多、皂苷釋放加快，提取率增大；若是超聲溫度過高，雜質(zhì)溶出增加，有效成分被破壞，而使提取率下降。因此，選定50℃為最佳超聲溫度，提取率達6.91%。

2.1.6乙醇濃度對絞股藍皂苷提取率的影響

當微波功率400 W，微波時間120 s，超聲溫度50℃，超聲時間60 min，液料比25∶1（mL/g），考察乙醇濃度60%、70%、80%、90%、100%對皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，皂苷的提取率隨乙醇濃度的增大而增加，當乙醇濃度為80%時提取率達到最大，這可能是因為絞股藍中皂苷的極性更接近濃度為80%的乙醇的極性。因此，試驗選取乙醇的最佳濃度為80%。

圖6　乙醇濃度對皂苷提取率的影響Fig.6　Effectofethanolconcentration on the extraction yield of saponins

2.2響應(yīng)面法試驗結(jié)果與分析

利用Design Expert7.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計[21]的試驗條件及試驗結(jié)果見表2。

對表2中試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程為：Y=6.87-0.055A+0.33B+0.093C+0.040AB+0.23AC+ 0.23BC-0.57A2-0.42B2-1.61C2。再對該模型進行響應(yīng)面分析，得出二次響應(yīng)回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3　二次響應(yīng)模型方差分析Table 3　ANOVA results of the fitted quadratic regression model

續(xù)表3　二次響應(yīng)模型方差分析Continue table 3　ANOVA results ofthe fitted quadratic regression model

由表3的ANOVA方差分析可知，模型的P值< 0.01，差異極顯著，說明回歸模型擬合程度較好，試驗誤差小，可以用該模型對乙醇微波超聲雙輔助提取絞股藍皂苷的提取率進行分析和預(yù)測。從F值可知，各因素對絞股藍皂苷提取率的影響順序為：B>C>A，即液料比﹥超聲溫度>微波時間；一次項B和C顯著，二次項A2、B2和C2極顯著，交互項AC、BC顯著，AB不顯著，說明二次項響應(yīng)值對試驗結(jié)果影響很大，不是簡單的一次線性關(guān)系。

對表3的分析結(jié)果作回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面，見圖7。

圖7　AB、AC和BC分別對皂苷提取率影響的響應(yīng)面Fig.7　The response surface of AB、AC and BC on extraction yield ofchlorogenic acid

表2　RSM試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2　Experimentaldesign and corresponding results for RSM

由圖7可知，響應(yīng)面都是開口朝下的拋物曲面，其中心位于試驗考察的區(qū)域范圍內(nèi)，說明在試驗單位內(nèi)所考察指標存在最大值。

利用Design Expert 7.0軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，可得絞股藍皂苷提取的最佳工藝條件為微波時間117.12 s、液料比27.75∶1（mL/g）、超聲溫度51.24℃，在該條件下絞股藍皂苷提取率預(yù)測值為7.01%。

為了檢驗響應(yīng)面法的可靠性，在上述最佳工藝條件進行絞股藍中皂苷微波超聲雙輔助提取的試驗，平行3次，同時考慮實際操作情況，將絞股藍皂苷最佳工藝條件修正為：微波時間117 s、液料比28∶1（mL/g）、超聲溫度51℃，實際得到絞股藍皂苷提取率的平均值為7.05%，與預(yù)測值基本吻合，其相對誤差約為0.57%。從而證實該模型可用于絞股藍皂苷的提取。與其他方法相比，微波超聲雙輔助提取絞股藍皂苷的提取率較高，提取時間較短。

3　結(jié)論

以絞股藍為原料，采用微波超聲雙輔助提取皂苷，通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面法試驗得到優(yōu)化的工藝參數(shù)：微波時間117 s、液料比28∶1（mL/g）、超聲溫度51℃、乙醇濃度80%、超聲溫度為60℃、超聲時間60 min，在該條件下驗證絞股藍皂苷提取率的平均值為7.05%，與預(yù)測值基本吻合，說明此模型用于絞股藍皂苷的提取工藝是可行的。絞股藍皂苷提取工藝經(jīng)優(yōu)化后提取率得到有效提高，可再為絞股藍的再利用提供參考。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學出版社,1986:265-277

[2] 陳書坤.絞股藍屬植物的分類系統(tǒng)和分布[J].植物分類學報, 1995,33(4):403-410

[3]張濤,袁弟順.中國絞股藍種質(zhì)資源研究進展[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,2009,24(3):459-465

[4]江波,蘭小中.藥用植物絞股藍的研究新進展[J].西藏科技,2005 (12):52-54

[5]巫世紅,胡豐,楊晨,等.絞股藍的藥理作用研究近況[J].廣西中醫(yī)學院學報,2008,11(1):86-88

[6] 陳幾香,張建國.絞股藍總皂苷保肝作用實驗研究[J].中國藥業(yè), 2007,16(13):7-8

[7]潘峰,劉迪,黃翠霞.絞股藍皂甙的藥理與臨床研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,15(5):674-676

[8]陳武,伍曉春,鄒盛勤,等.絞股藍總皂苷提取工藝的研究[J].食品與機械,2008,24(1):75-77

[9]鄧美林,吳天祥.乙醇提取絞股藍超微粉總皂苷的研究[J].中國釀造,2009,205(4):52-55

[10]譚文,陶湘輝,周躍斌.絞股藍皂苷提取工藝的研究[J].農(nóng)業(yè)科技, 2008(14):103-104

[11]董玉睿.絞股藍總皂苷提取工藝研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2007,14(6):48-49

[12]張育松.微波輔助提取絞股藍皂苷的初步研究[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究,2008,4(3):225-228

[13]郭輝力,鄧澤元.微波干法輔助提取絞股藍總皂苷的研究[J].食品與機械,2009,25(1):68-71

[14]鄧美林,付莉,吳天祥.纖維素酶法提取絞股藍總皂苷的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2009,37(2):15-17.

[15]宋小妹,崔九成,強軍,等.超聲法提取絞股藍總皂甙的工藝研究[J].中成藥,1998,20(5):4-5.

[16]林碩,岳琳娜,高學玲,等.超聲波強化提取絞股藍皂苷的工藝研究[J].食品科學,2009,30(14):72-75

[17]陳蘭,李喜宏,王騰月,等.響應(yīng)面法優(yōu)化棗核總黃酮超聲提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(24):292-295

[18]吳美媛,王喜周,余甜女.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化微波提取猴頭菇多糖工藝[J].食品研究與開發(fā),2014,35(9):23-26

[19]陳業(yè)高,海麗娜,畢先均.微波輻射在天然藥用活性成分提取分離中的應(yīng)用[J].微波學報,2003,20(2):85-89

[20]尤秀麗,池路花,曹蕓梅,等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波超聲雙輔助提取金銀花綠原酸工藝[J].食品工業(yè)科技,2014,35(12):272-276

[21]王欽德,楊堅.食品實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2003:13-16

Optimization of Microwave-ultrasonic-assisted Extraction of Saponins from Gynostemma
pentaphyllum Using Response Surface Methodology

YOU Xiu-li1，2，ZHENG Jian-zhong1，2，CHEN Rong1，CAIXiao-dan1，LIQiong1，TAN Chang-hui1，2
（1.Colllege of Chemistry and Environment，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，F(xiàn)ujian，China；2.Fujian Province Key Laboratory of Morden Analytical Science and Separation Technology，Zhangzhou 363000，F(xiàn)ujian，China）

The microwave-ultrasonic-assisted extraction ofsaponins from Gynostemma pentaphyllum was optimized using response surface methodology.Base on single-factor experiments，the extraction conditions ofmicrowave-ultrasonic-assisted extraction yield of saponins in the Gynostemma pentaphyllum were by RSM.As a result，a quadratic polynomial mathematical model was built.The optimal extraction conditions of RSM were determined as follows：Gynostemma pentaphyllum were suspended in microwave power of 400 W，subjected to ultrasonic treatment for 60 min at temperature of 51℃，80% ethanol concentration at solvent-to-solid ratio 28∶1（mL/g）and then microwaves 117 s.The resultofverification experiment（7.05%）was coincided with predictive value.

response surface methodology；microwave-ultrasonic-assisted extraction；Gynostemma pentaphyllum；saponins

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.012

福建省教育廳科技項目（JA12218）；福建省教育廳科技項目（JA15310）

尤秀麗（1978—），女（漢），副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的提取、手性識別機理研究。

2015-01-19