黃琦，王啟越，李穎，葉春林（.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州30023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州30023）

石榴皮總多酚的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

黃琦1，2，王啟越1，李穎1，葉春林1，2
（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023）

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化石榴皮總多酚的微波輔助提取工藝，以總多酚得率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取功率和液固比4個(gè)主要因素對石榴皮總多酚得率的影響。采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，建立了回歸方程的預(yù)測模型，確定最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、提取時(shí)間98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。此條件下總多酚得率為（23.26±0.15）%。試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值基本相符。用紅外光譜對總多酚提取物進(jìn)行了表征。石榴皮總多酚對DPPH自由基的半清除質(zhì)量濃度為0.28 mg/mL，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

石榴皮；總多酚；響應(yīng)面分析法；微波輔助提??；抗氧化活性

石榴皮是《中國藥典》收載的一種中草藥[1]，Saito 等[2]研究發(fā)現(xiàn)石榴皮提取物的抗氧化能力在日本上千種藥用植物中位列第一，且其抗氧化活性與多酚含量相關(guān)。石榴皮總多酚不僅具有較強(qiáng)的抗氧化性，還有抗菌、消炎、驅(qū)蟲、澀腸、止血等功效，具有廣闊的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。石榴皮總多酚大多以苯環(huán)的多羥基取代為特征，主要包括黃酮類、鞣質(zhì)類和有機(jī)酸類化合物[3-4]。本研究利用響應(yīng)面法對微波輔助提取石榴皮中總多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化，先采用單因素試驗(yàn)分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比和提取功率對總多酚得率的影響，再通過響應(yīng)面優(yōu)化得出最佳提取條件，并對提取的總多酚進(jìn)行紅外光譜結(jié)構(gòu)表征。通過石榴皮總多酚對DPPH自由基的清除作用測定其抗氧化活性，以期為石榴皮的深入開發(fā)與應(yīng)用提供試驗(yàn)和理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

陜西石榴皮葉烘干、粉碎，過60目篩，置陰涼干燥處備用。DPPH自由基、維生素C（VC）：美國sigma公司；福林酚試劑：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；沒食子酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、碳酸鈉（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2主要儀器設(shè)備

WGD2S.01型微波設(shè)備：南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司；DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市大德中藥器械有限公司；低速離心機(jī)：江蘇天力醫(yī)療器械有限公司；752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；BSA224S萬分之一電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋：杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取10 mg已干燥至恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得100μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別精確量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于25 mL的具塞容量瓶中，采用福林法參照文獻(xiàn)[5]方法測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)、沒食子酸的濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2石榴皮總多酚的提取和測定

準(zhǔn)確稱取0.4 g石榴皮粉末，加一定體積的乙醇-水溶液，在特定的微波功率下提取，然后迅速冷卻，4 000 r/min離心15 min，殘?jiān)瓷鲜鰲l件重復(fù)提取1次，合并上清液，用提取溶劑定容至50 mL。

1.3.3石榴皮總多酚得率

準(zhǔn)確移取待測液0.1mL，置于25 mL的具塞試管中，參照1.3.1方法測定總多酚吸光度，代入回歸方程，按沒食子酸當(dāng)量計(jì)算總多酚含量。總多酚得率/%=提取液中總多酚質(zhì)量/原料質(zhì)量×100。

1.3.4單因素試驗(yàn)

石榴皮粉末過60目篩后，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比和提取功率對總多酚得率的影響。

1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化分析石榴皮總多酚提取工藝

采用Design-Expert8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總多酚得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.3.6石榴皮中總多酚的紅外光譜表征

上述總多酚提取物烘干、KBr壓片，在波數(shù)400 cm-1～4 000 cm-1處掃描。

1.3.7對DPPH自由基的清除作用

參考Ye等[6]的方法測定，以VC為參比，測定石榴皮總多酚提取物對DPPH自由基的清除作用。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.3.1方法得到總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：A=0.110 7C+0.009 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。

2.2單因素試驗(yàn)

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，道路交通建設(shè)實(shí)現(xiàn)了高速發(fā)展，同時(shí)隨著人們生活水平和人均收入的不斷提高，購買私家車的家庭也逐年增多。私家車數(shù)量上的增多一方面給人們的生活帶來了極大的便利，另一方面增加了城市交通管理的復(fù)雜性，交通事故出現(xiàn)的概率較往年而言也有了大幅度的增加，其中酒駕事故的頻頻發(fā)生，不僅給自身而且也給社會安全帶來了極大危險(xiǎn)，由此，人們對于該方面的立法也給予了足夠的關(guān)注和認(rèn)識。

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對總多酚得率的影響

在提取時(shí)間60 s，液固比30∶1（mL/g），微波功率200 W條件下，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（30%、40%、50%、60%、70%）提取石榴皮總多酚，結(jié)果見圖1。

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對總多酚得率的影響Fig.1　Effects ofethanolconcentration on extraction yield of total polyphenols

從圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對石榴皮總多酚得率有較大影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，總多酚得率最高，隨后有所下降。根據(jù)相似相溶原理，可能是總多酚極性與60%的乙醇溶液的極性相似。另外，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，脂溶性物質(zhì)溶出也增加，干擾因素也隨之增大。

2.2.2微波提取時(shí)間對總多酚得率的影響

在液固比30∶1（mL/g），微波功率200 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)的60%的條件下，改變提取時(shí)間（30、60、90、120、150 s）提取石榴皮總多酚，結(jié)果見圖2。

圖2　提取時(shí)間對總多酚得率的影響Fig.2　Effects ofextraction time on extraction yield of total polyphenols

從圖2可知，提取時(shí)間對總多酚得率的影響呈先上升后下降的趨勢，90 s附近時(shí)總多酚得率達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，石榴皮總多酚浸出太少；提取時(shí)間過長時(shí)，可能是由于溫度的升高導(dǎo)致總多酚不穩(wěn)定而被破壞分解，從而使得率略有下降趨勢。

2.2.3微波提取功率對總多酚得率的影響

在液固比30∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)的60%，提取時(shí)間60 s的條件下，改變微波提取功率（100、200、300、400、500、600 W）提取石榴皮總多酚，結(jié)果見圖3。

圖3　提取功率對總多酚得率的影響Fig.3　Effects ofe the microwave power on extraction yield of total polyphenols

2.2.4液固比對總多酚得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)的60%，提取時(shí)間60s，微波提取功率200W的條件下，改變液固比 [10∶1、20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1（mL/g）]提取石榴皮總多酚，結(jié)果見圖4。

圖4　液固比對得率的影響Fig.4　Effects of liquid-solid ratio on extraction yield of total polyphenols

從圖4可知，液固比對石榴皮總多酚的提取得率有影響，提取得率隨液固比增加而增大，其中30∶1（mL/g）之后的增長率變得緩慢。濃度差所產(chǎn)生的滲透壓力是植物細(xì)胞組織與提取溶劑之間相平衡過程的主要推動力，而液固比反映了濃度差，濃度差越大，擴(kuò)散推動力就越大，從而有利于提高浸取效率。但是過高的液固比，并不會明顯提高提取效果，并且會消耗大量的溶劑。

2.3石榴皮總多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總多酚得率為目標(biāo)函數(shù)，綜合2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、微波提取時(shí)間（B）、微波提取功率（C）和液固比（D）為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面因素水平見表1，設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2，回歸二次方程的方差顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果見表3。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1　Experimentalfactors and levels in response surface design

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Arrangement and experimentalresults ofresponse surface design

表3　響應(yīng)面分析法對總多酚得率的方差分析Table 3　Analysis ofvariance ofthe constructed regression model

采用Design-Expert8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果建立二次響應(yīng)面回歸模型，以石榴皮總多酚得率為響應(yīng)值的回歸方程為：得率＝-11.505 08＋0.712 75A＋0.089 494B+ 0.057 090C+0.100 70D－2.083 33×10-4AB－5.8×10-4AC＋2.45×10-3AD＋8×10-5BC＋1.4×10-3BD－3.375×10-4CD－5.860 83×10-3A2－8.456 48×10-4B2－3.085 83×10-5C2－2.785 83×10-3D2。

由表3可知，以石榴皮中總多酚得率為響應(yīng)值時(shí)，回歸方程顯著性檢驗(yàn)P<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著；同時(shí)，失擬項(xiàng)P=0.142 5>0.100 0，不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合度良好，即可用該數(shù)學(xué)模型推測試驗(yàn)結(jié)果[7]。模型的R2=0.946 1，說明響應(yīng)值的94.61%是由于所選變量引起，表明該方程具有較好的擬合相關(guān)性，可以用該回歸方程確定最佳提取工藝[8-9]。另外，所建模型的變異系數(shù)（C.V.）為0.99%，表明模型重復(fù)性良好[10]。通過模型的回歸方差分析（表3）可以看出，4個(gè)因素對得率的影響都是極顯著的（P<0.01），交互相AC、BD、CD對試驗(yàn)結(jié)果的影響也是極顯著的（P< 0.01），交互相AD、BC（P<0.05）對試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。

2.3.2提取工藝的響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

各因素之間的交互作用繪制響應(yīng)面曲線圖，見圖5～圖10。

圖5　乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對總多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.5　Response surface and contour line of ethanolconcentration and extraction time

圖6　乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取功率對總多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.6　Response surface and contour line of ethanolconcentration and extraction power

圖7　乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比對總多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.7　Response surface and contour line of ethanolconcentration and liquid-solid ratio

圖8　提取時(shí)間和提取功率對總多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.8　Response surface and contour line ofextraction time and extraction power

圖9　提取時(shí)間和液固比對總多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.9　Response surface and contour line ofextraction time and liquid-solid ratio

圖10　提取功率和液固比對總多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.10　Response surface and contour line ofextraction power and liquid-solid ratio

等高線圖可反映出2個(gè)變量間交互作用的顯著程度，等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強(qiáng)，等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡[11]。由圖5可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間等高線圖的圓心趨于圓形，兩因素交互作用不顯著，而圖6～圖10所示的兩因素交互作用較顯著。由圖5～圖7可見，總多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而升高，但升高到一定程度以后，略有下降，根據(jù)相似相溶的原理，最佳的乙醇濃度是由石榴皮總多酚的極性決定的。由圖5、圖8和圖9可見，總多酚得率隨著提取時(shí)間的增大先增大后減小，根據(jù)提取動力學(xué)理論，提取時(shí)間的延長有助于總多酚的充分?jǐn)U散析出，但過長的提取時(shí)間會加劇總多酚在較高溫度環(huán)境中的破壞，從而影響了總多酚的得率。由圖6、圖8和圖10可見，總多酚得率隨著提取功率的增大而增加，但升高到一定程度以后，趨于平緩，因?yàn)樘崛」β试龃笫沟脺囟壬?，提取的總多酚增多的同時(shí)使得一部分對熱不穩(wěn)定的成分被破壞，從而影響了得率。由圖7、圖9和圖10可見，總多酚得率隨液固比的增大先增大，后趨于平穩(wěn)略有減小。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，在選取的4個(gè)因素試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，得出石榴皮總多酚的理論最佳微波輔助提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、提取時(shí)間98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。在此提取工藝條件下連續(xù)進(jìn)行3次石榴皮總多酚的提取試驗(yàn)，測得平均得率為（23.26±0.15）%，與預(yù)測得率23.30%接近，說明該模型與實(shí)際情況擬合性良好。

2.4紅外光譜分析

提取物紅外光譜掃描見圖11。

圖11　總多酚樣品的紅外光譜圖Fig.11　IR spectrogram for sample

由圖11可知，3 368.07 cm-1處有強(qiáng)寬的吸收峰對應(yīng)O-H伸縮振動；1 702.82、1621.44 cm-1對應(yīng)羰基吸收峰，1 521.05、1 483.97 cm-1處的吸收峰對應(yīng)芳環(huán)上的骨架振動；1 406.08、1 334.42 cm-1處的吸收峰對應(yīng)次甲基面內(nèi)彎曲振動，1 300 cm-1～1 000 cm-1有C-O的伸縮振動峰，900 cm-1～650 cm-1有多個(gè)吸收峰，說明苯環(huán)上有多個(gè)取代結(jié)構(gòu)。紅外光譜特征和文獻(xiàn)[12]報(bào)道多酚類化合物紅外光譜特征一致，可確認(rèn)化學(xué)組成為多酚類物質(zhì)。

2.5對DPPH自由基的清除作用測定

石榴皮總多酚提取物和VC對DPPH自由基清除作用見圖12。

由圖12可見，隨著石榴皮總多酚提取物的濃度增加，對DPPH自由基清除能力也增大?？偠喾犹崛∥锖蚔C的半清除質(zhì)量濃度（IC50）分別為0.28 mg/mL 和0.26 mg/mL，兩者對DPPH自由基清除能力相近。

3　結(jié)論

微波輔助提取石榴皮總多酚的最佳提取工藝：以石榴皮粉末為原料，乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、提取時(shí)間98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。此條件下的平均得率為（23.26±0.15）%，與預(yù)測值相符，可用于微波輔助提取石榴皮總多酚得率的預(yù)測和分析。利用紅外光譜對石榴皮總多酚進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，符合多酚類化合物紅外光譜特征。提取物對DPPH自由基清除作用的IC50為0.28 mg/mL，說明石榴皮總多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力。石榴皮總多酚的深入開發(fā)和利用有待進(jìn)一步研究。

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Study on Microwave Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Polyphenols from Pomegranate Rind

HUANG Qi1，2，WANG Qi-yue1，LIYing1，YE Chun-lin1，2
（1.School of Biologicaland Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemicaland Biological Processing Technology ofFarm Products，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

Response surface method was used to optimize the technologicalconditions ofmicrowave assisted extracting total polyphenols from pomegranate rind.Extraction yield of polyphenols as an indicator，single factorexperiment and response surface method were used to discuss the influence on extraction yield by the ethanol concentration，extraction time，the microwave power and liquid-solid ratio.The regression equation prediction model was developed by Box-Benhnken center combination design and response surface method.The optimal extract conditions were as follows：ethanol concentration 58%，extracting time 98 s，the microwave power 235 W，liquid-solid ratio 49∶1（mL/g）.Under the condition，the extraction yield of polyphenols was（23.26± 0.15）%.The obtained polyphenols was characterized by IR spectra.The IC50values ofthe obtained extracts against DPPH free radicals was 0.28 mg/mL，suggesting that polyphenols from pomegranate rind had a remarkable antioxidanteffect.

pomegranate rind；totalpolyphenols；response surface method；microwave assisted extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.011

國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201511057011）；浙江省高等學(xué)校國內(nèi)訪問學(xué)者專業(yè)發(fā)展項(xiàng)目（2015-58）

黃琦（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品、藥品質(zhì)量安全與控制。

2015-06-09