羅華榮，劉昭輝，吳登龍，洪　哲，趙　鑫，王天如

(上海市同濟醫(yī)院，上海　200065)

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膀胱尿路上皮癌與正常尿路上皮組織LncRNA表達譜差異性的研究

羅華榮，劉昭輝，吳登龍，洪哲，趙鑫，王天如

(上海市同濟醫(yī)院，上海200065)

目的利用基因芯片技術(shù)，檢測人膀胱尿路上皮癌與正常膀胱組織之間LncRNA表達譜的差異，對差異表達的LncRNA進行分類匯總，分析其生物學(xué)信息。方法取人膀胱尿路上皮癌組織與配對的癌旁正常組織3對。分別提取尿路上皮癌組織及正常癌旁組織的總RNA并純化RNA，與人LncRNA芯片雜交。使用Agilent Genespring GX (Agilent)軟件分析尿路上皮癌組織及正常癌旁組織的LncRNA表達情況。結(jié)果人膀胱尿路上皮癌組織與配對的癌旁正常組織的LncRNA表達譜差異明顯。以P<0.05, 上調(diào)或下調(diào)信號差異大于2倍變化為標(biāo)準(zhǔn),與正常膀胱組織比較，共篩選出差異表達基因1 122個，其中上調(diào)基因734個，下調(diào)基因388個。結(jié)論膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因調(diào)控、多條染色體參與的復(fù)雜過程。所獲得的膀胱癌差異表達LncRNA，尤其差異表達明顯的上調(diào)基因AK124776、lincRNA-RAB12-1、KRT8P25、RP11-474J18.4、AC000110.1、KRT8P13、KRT8P10、BC072678等、下調(diào)基因nc-HOXB9-206、RP11-160A10.2、nc-HOXA11-86、nc-HOXD10-7、nc-HOXB9-205、CES4、nc-HOXD12-3等，考慮上述上調(diào)、下調(diào)基因?qū)τ诎螂装┌l(fā)生的分子機制及膀胱癌的臨床早期診療具有重要意義。

LncRNA;基因芯片;膀胱;尿路上皮癌;表達譜

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.07.015

膀胱惡性腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，全球范圍內(nèi)占惡性腫瘤發(fā)病率的第9位[1]，其病理類型包括尿路上皮細(xì)胞癌(urothelial carcinoma，UCC)，腺細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌等，其中UCC是最常見的病理類型。膀胱腫瘤的治愈與否完全取決于是否能夠早期預(yù)防、早期診斷、早期治療，所以尋找合適的敏感性高、特異性強的腫瘤標(biāo)志物成為了我們研究的重點。

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對UCC發(fā)生發(fā)展過程中的細(xì)胞和分子水平的變化有了更深刻全面的認(rèn)識，并進行了大量研究試圖探討UCC發(fā)生的分子和細(xì)胞機制，尋找膀胱腫瘤的特異性標(biāo)志物。UCC發(fā)生發(fā)展的許多環(huán)節(jié)尚不能用單一的分子或基因變化來解釋，UCC的發(fā)生和發(fā)展涉及復(fù)雜的，多步驟的及多種基因的參與過程。至今發(fā)現(xiàn)并報道可能和膀胱腫瘤有關(guān)的標(biāo)志物包括DNA甲基化標(biāo)志物、mRNA標(biāo)志物、細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)標(biāo)志物[2-17]。雖然如此，但是尚未找到膀胱腫瘤特異性標(biāo)志物。近幾年發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA(LncRNA)同樣也參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度大于200 nt，但不具備編碼蛋白質(zhì)功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。相較于小分子RNA(microRNA)，LncRNA仍較陌生，也是目前非編碼RNA的研究熱點[17]。但LncRNA在膀胱癌中的作用機制仍不清晰。本研究使用基因芯片這一先進手段，以正常膀胱黏膜組織為對照，對膀胱尿路上皮癌的非編碼長鏈RNA(LncRNA)基因表達譜變化進行研究，為進一步探討LncRNA在膀胱腫瘤的作用提供一定的幫助，試圖從LncRNA的角度去尋找膀胱腫瘤的特異性基因。

1　材料與方法

1.1一般資料膀胱癌組織與配對的癌旁組織3對,來自2012年3～4月在我科進行手術(shù)的膀胱癌患者，膀胱癌組織經(jīng)病理證實為尿路上皮癌,癌旁組織經(jīng)病理證實為正常膀胱組織。所有組織標(biāo)本手術(shù)切除后，迅速放入液氮中冷凍。后標(biāo)號儲存于-80 ℃冰箱中備用。患者均為男性，患者及標(biāo)本的一般情況見表1，癌細(xì)胞免疫組織化學(xué)見表2。

表1UCC患者及其腫瘤一般情況

序號樣本號性別年齡(歲)病理分級(WHO1973)臨床分期(UICC)腫瘤體積(cm)腫瘤數(shù)目癌旁組織樣本號1B93T男541級T11.0×2.21B93C2B95T男651級T10.8×1.31B95C3B98T男633級T32.0×2.23B98C

WHO ：世界衛(wèi)生組織；UICC：國際抗癌聯(lián)盟。

表2癌細(xì)胞免疫組化

樣本免疫標(biāo)記CK廣CK7P63P53Ki-67CD44CK20B93T+++++(5%)+(少量)+(部分)B95T++++(部分)+(10%)+(部分)+B98T++++---

Trizol試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，人LncRNA芯片 8×60 k(Arraystar公司)，雜交盒 (Agilent公司)，單色標(biāo)記試劑盒 (Agilent公司)，基因表達雜交試劑盒(Agilent公司)，Baseline-zERO Dnase(Epicentre公司)，RNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司)，RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)，Agilent Micmarray scanner掃描儀均為Agilent公司產(chǎn)品。Agilent Feature Extraction (FE) 軟件(Agilent 公司)。Genespring GX 分析軟件(Agilent公司)。

1.2樣本RNA的提取每50～100 mg組織樣品，加入1 mL Trizol試劑，用電動勻漿器進行勻漿。勻漿后加入0.2 mL的氯仿分離，與異丙醇混合以沉淀其中的RNA。移去上清液，每1 mL Trizol試劑勻漿的樣品中加入至少1 mL 75%乙醇，清洗RNA沉淀。去除乙醇溶液，溶解RNA時。

1.3RNA純化及質(zhì)控使用RNeasy spin column、無RNA酶的水洗滌RNA。用Agilent Nanodrop ND-1000測定A260、A280及A230的值并計算RNA 的濃度及純度。用甲醛變性凝膠電泳觀察RNA 5S、18S及28S的完整性。

1.4標(biāo)記及雜交使用單色標(biāo)記試劑盒，RNeasy Mini試劑盒等標(biāo)記樣本，使用NanoDrop ND-1000檢測cRNA產(chǎn)量和特異活性并標(biāo)記。使用人8×60 k的LncRNA芯片，雜交盒，基因表達雜交試劑盒在標(biāo)準(zhǔn)條件下將其雜交。

1.5芯片洗滌預(yù)熱足夠體積的基因表達洗滌緩沖液，室溫下將基因表達洗滌緩沖液1注滿滑動染色碟。洗滌開始后加入預(yù)熱的(37 ℃)基因表達洗滌緩沖液2進行洗滌。洗滌后立即掃描芯片，避免由于環(huán)境氧化對于掃描信號的影響。

1.6芯片掃描及數(shù)據(jù)分析將玻片裝入玻片架上。 裝入Agilent 掃描儀傳送帶并進行掃描。將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)保存。采用Agilent Microarray Scanner(G2505B)掃描芯片，將Agilent Feature Extraction軟件讀出的熒光值導(dǎo)入Agilent Genespring GX (Agilent)軟件中進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后得出實驗組與對照組標(biāo)記的信號比值(fold change)，即為該基因組在實驗組與對照組中變化情況。最后經(jīng)過t-test檢驗，篩選出fold change≥2的基因為表達顯著上調(diào)基因，F(xiàn)old change≤0.5為表達顯著下調(diào)基因(所有差異性基因均滿足P<0.05)。

2　結(jié)　果

6張芯片雜交結(jié)果經(jīng)軟件分析篩選，每張芯片有效雜交率均達到99%以上，分析各芯片質(zhì)量控制探針信號，認(rèn)為6張芯片雜交檢測的一致性高，結(jié)果可信。如圖1所示。

圖1芯片雜交結(jié)果分析

A:B93C;B:B93T;C:B95;D:B95T;E:B98C;F：B98T。

2.1芯片雜交結(jié)果的聚類分析收集6對樣品有效表達基因檢測的Ratio值，采用Cluster軟件進行系統(tǒng)聚類分析(圖2)，圖形顯示差異生物標(biāo)記物表達基因的信號強度，顏色表示信號值的強度，由粉色-紅色，信號值依次增加，紅色-綠色代表高表達，藍(lán)色-粉色代表低表達。

圖2　6組芯片雜交結(jié)果聚類分析

2.2芯片雜交信號散點圖散點圖能直觀反映腫瘤組與對照組之間LncRNA差異表達的變化程度。經(jīng)數(shù)據(jù)均一化處理后構(gòu)建散點圖(圖3)。圖中上方綠線上方區(qū)域是2倍以上上調(diào)的差異表達的lncRNA，下方綠線下方區(qū)域是2倍以上下調(diào)的差異表達lncRNA。

圖3　芯片雜交信號散點圖

上方綠線的上方區(qū)域以及下方綠線的下方區(qū)域是2倍以上的差異表達。

2.3LncRNA 差異表達結(jié)果通過將3例癌組織的基因表達譜分別與對照組的基因表達譜進行對比研究。結(jié)果顯示，膀胱癌組與對照組相比，以P<0.05、 上調(diào)或下調(diào)信號差異大于2倍變化為標(biāo)準(zhǔn),與正常膀胱組織比較，共篩選出差異表達基因1 122個，其中上調(diào)基因734個，下調(diào)基因388個。分別例舉上調(diào)和下調(diào)10倍以上的LncRNA(表3、表4)。差異表達LncRNA染色體分布(圖4)。

表3膀胱尿路上皮癌上調(diào)10倍以上差異表達LncRNA

序列名稱基因名稱色譜上調(diào)倍數(shù)類型探針名稱uc003cmy.1AK124776chr326.29291非編碼RNAASHG19A3A022520C20652lincRNA-RAB12-1chr1818.844774非編碼RNAASHG19A3L0003342AK000839/chr1716.210579非編碼RNAASHG19A3A008508ENST00000473150KRT8P25chr315.875776非編碼RNAASHG19A3A022860ENST00000512863RP11-474J18.4chr515.131286非編碼RNAASHG19A3A027163ENST00000431957AC000110.1chr715.049078非編碼RNAASHG19A3A035014ENST00000463294KRT8P13chr314.981011內(nèi)含子 反義轉(zhuǎn)錄RNAASHG19A3A023526ENST00000450021KRT8P10chr214.825374非編碼RNAASHG19A3A014732uc001rjo.1BC072678chr1214.747757非編碼RNAASHG19A3A048481ENST00000448540RP11-111E2.1chr914.659423內(nèi)含子 反義轉(zhuǎn)錄RNAASHG19A3A038816ENST00000504509RP11-789C1.1chr414.507504非編碼RNAASHG19A3A026300ENST00000414328RP11-110J1.3chr114.4582815非編碼RNAASHG19A3A032876ENST00000399149SFRS9P1chr2114.17717非編碼RNAASHG19A3A018851ENST00000449217RP3-452M16.1chrX14.110057非編碼RNAASHG19A3A040138ENST00000413425KRT8P18chr313.99092非編碼RNAASHG19A3A020870ENST00000440275KRT8P7chr1113.342168非編碼RNAASHG19A3A045784ENST00000451609RP11-543F8.1chr1013.288165非編碼RNAASHG19A3A042424EC495588lincRNA-RCN2chr1512.822171非編碼RNAASHG19A3L0002752ENST00000367074GS1-309P15.4chrX12.674266非編碼RNAASHG19A3A040786ENST00000424882GS1-309P15.3chrX12.63172非編碼RNAASHG19A3A039699ENST00000485873RP4-621B10.3chr112.627898非編碼RNAASHG19A3A048157ENST00000398745KRT8P26chr1112.41178非編碼RNAASHG19A3A046607ENST00000511504RP11-790I12.1chr412.265042非編碼RNAASHG19A3A025622nc-HOXB4-176+nc-HOXB4-176chr1712.118851非編碼RNACUST_54_PI426075208ENST00000454391AL358913.1chr1411.904219非編碼RNAASHG19A3A050730ENST00000497538RP11-111F10.2chr311.498124非編碼RNAASHG19A3A023430ENST00000392131AC079305.6chr211.317965非編碼RNAASHG19A3A016645ENST00000510090RP11-618I10.2chr411.099051非編碼RNAASHG19A3A025620ENST00000434750AC108171.5chrX10.894489非編碼RNAASHG19A3A041704ENST00000453086RP5-1091N2.3chrX10.1777935非編碼RNAASHG19A3A040026

表4膀胱尿路上皮癌下調(diào)10倍以上差異表達lncRNA

續(xù)表4

序列名稱基因名稱色譜下調(diào)倍數(shù)類型探針名稱AK026384chr226.26481非編碼RNAASHG19A3A016486nc-HOXB9-205-nc-HOXB9-205chr1725.701212外顯子ASHG19A3H0000076ENST00000421606CES4chr1624.578844非編碼RNAASHG19A3A054608nc-HOXD12-3-nc-HOXD12-3chr221.637152外顯子ASHG19A3H0000174uc002tjx.3AY343891chr220.35203非編碼RNAASHG19A3A014229ENST00000416700RP11-58A12.3chr917.737352非編碼RNAASHG19A3A038722AL109696chr1515.587008非編碼RNAASHG19A3A052517uc010mam.2AF131817chr815.372687外顯子ASHG19A3A035947uc003tcg.2AK124304chr715.336274外顯子ASHG19A3A034154ENST00000442797AC007064.21chr2215.284027非編碼RNAASHG19A3A020031AL390167chr1314.648443非編碼RNAASHG19A3A049319ENST00000514910RP11-451F20.1chr414.038315非編碼RNAASHG19A3A026355uc003xjb.2BC034319chr813.934998非編碼RNAASHG19A3A036526CF129145lincRNA-LOC100506581-1chr1613.665986非編碼RNAASHG19A3L0000894uc001awc.1AK055853chr113.640614反義轉(zhuǎn)錄RNAASHG19A3A012055AK125472chr1313.590306非編碼RNAASHG19A3A049853uc001gla.1CR621436chr112.739795非編碼RNAASHG19A3A035511uc004ags.1AK130904chr912.102253反義轉(zhuǎn)錄RNAASHG19A3A038744AF087976chr311.665831非編碼RNAASHG19A3A022767G65639chr510.440295非編碼RNAASHG19A3A026776AK307235lincRNA-SRD5A2chr210.403127外顯子ASHG19A3L0001181ENST00000439715RP11-282E4.1chr910.397835非編碼RNAASHG19A3A038699ENST00000434499RP11-145A3.4chr110.215157非編碼RNAASHG19A3A040793

圖4差異表達LncRNA染色體分布情況

3　討　論

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200核苷酸的非編碼RNA分子。LncRNA最初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。然而，近年來的研究表明它可在多層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達。它參與了基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、染色體沉默和修飾等過程[17]，目前其作用機制包括干擾下游基因表達、影響編碼蛋白基因轉(zhuǎn)入及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能等[18]。隨著對LncRNA研究的深入，證明LncRNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤包括膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，正常組織和腫瘤組織的LncRNA表達存在明顯的差異[19]，而且在同一腫瘤的不同階段LncRNA表達也存在明顯的差異[20]。雖然其發(fā)揮的功能未被深入了解，影響腫瘤形成和進展的機制尚不清楚，但其將來潛在價值是不言而喻的。其中的大量LncRNA具有高度的保守性，存在特定的基因序列，在人類正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都存在著廣泛表達，有很多拷貝，分布在染色體的特定位點和腫瘤相關(guān)區(qū)域。某些LncRNA與膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有助于將來膀胱腫瘤的預(yù)防、診斷和治療。

本實驗中，我們采用芯片技術(shù)將人膀胱尿路上皮癌和正常配對膀胱組織進行LncRNA表達譜篩查，兩者LncRNA差異表達明顯，所獲得的差異表達LncRNA基因總共1 122個，包括上調(diào)和下調(diào)基因，而且各條染色體上均有分布，所以顯而易見，膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因調(diào)控、多條染色體參與的復(fù)雜過程。

目前本實驗獲得的差異表達明顯(上調(diào)或下調(diào)顯著)的LncRNA，檢索文獻尚無膀胱癌相關(guān)功能、機制方面報道，其可能對膀胱癌發(fā)生的分子機制及膀胱癌的臨床診療具有重要的意義，需要更進一步的研究證實。變化顯著的上調(diào)基因AK124776、lincRNA-RAB12-1、KRT8P25等、下調(diào)基因nc-HOXB9-206、RP11-160A10.2、nc-HOXA11-86等是研究的重點。也許其中就有膀胱癌特異性基因，幫助膀胱癌的預(yù)防、早期診斷、靶向治療。

雖然芯片技術(shù)具有高敏感、高特異性的特點，但是目前LncRNA基因芯片價格昂貴，篩查例數(shù)少，今后需進一步擴大樣本量，使篩查結(jié)果更具代表性。

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(編輯王瑋)

Gene microarray analysis of LncRNA expression profile in human urothelial carcinoma of the bladder

LUO Hua-rong, LIU Zhao-hui, WU Deng-long, HONG Zhe, ZHAO Xin, WANG Tian-ru

(Tongji Hospital of Shanghai City, Shanghai 200065, China)

Objective To analyze the expression profile of LncRNA in normal urinary bladder tissue and bladder urothelial carcinoma, to gather and classify the differently expressed LncRNA, and to analyze the biological information. MethodsA total of 3 specimens of bladder urothelial carcinomas and 3 specimens of normal urinary bladder tissues were collected. Total RNA was isolated, purified and hybridized with human LncRNA. The expressions of LncRNA urothelial carcinomas and adjacent normal tissues were analyzed with Agilent Genespring GX (Agilent) software. ResultsThe expression profile of LncRNA was significantly different between normal urinary bladder tissues and bladder urothelial carcinomas. Compared with normal urinary bladder tissues, the bladder urothelial carcinoma had 1 122 differently expressed genes (P<0.05), of which 734 were upregulated and 388 were downregulated. ConclusionsBladder urothelial carcinoma involves the regulation of multiple genes and participation of multiple chromosomes. Differently expressed LncRNA involve upregulated genes including AK124776, lincRNA-RAB12-1, KRT8P25, RP11-474J18.4, AC000110.1, KRT8P13, KRT8P10, BC072678 and downregulated genes including nc-HOXB9-206, RP11-160A10.2, nc-HOXA11-86, nc-HOXD10-7, nc-HOXB9-205, CES4, nc-HOXD12-3 and so on. Further research into these LncRNA will help to clarify the mechanism of bladder urothelial carcinoma, and to guide the early diagnosis and treatment.

LncRNA; gene microarray; urinary bladder; urothelial carcinoma; expression profile

2016-01-14

2016-03-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81172426)；上海市教委創(chuàng)新重點項目(No.12ZZ034)

王天如，副主任醫(yī)師.E-mail：tj6611@sina.com

羅華榮(1980-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師.研究方向：膀胱腫瘤.E-mail:huarongluo8@sina.com.

劉昭輝(1987-)，男(蒙古族)，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：前列腺腫瘤.E-mail:hui3579lina@163.com,系共同第一作者.

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