敖元云 虞結(jié)梅 周冬梅 靳淼 李莉莉 段招軍

100052北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室

GIV諾如病毒熒光定量一步RT-PCR方法的建立

敖元云 虞結(jié)梅 周冬梅 靳淼 李莉莉 段招軍

100052北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室

目的 建立靈敏、特異的GIV諾如病毒的熒光定量檢測方法。方法 合成針對GIV諾如病毒的特異性引物以及Taqman探針，優(yōu)化反應(yīng)體系及條件，根據(jù)我國新發(fā)人GIV諾如病毒序列（GenBank序列號：KC894731）構(gòu)建熒光定量檢測的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，對其靈敏度、特異性、重復(fù)性進(jìn)行評估，以傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-po1ymerase chain reaction，RT-PCR）的方法作為參考評價。結(jié)果 該方法檢測的靈敏度可以達(dá)到1.0×102拷貝/μ1，檢測范圍為102～108拷貝/ μ1；與GI、GII諾如病毒、腸道腺病毒、輪狀病毒、星狀病毒等無交叉反應(yīng)；批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗的循環(huán)閾值（Ct）變異系數(shù)（CV）分別小于1.31%和3.68%；在陽性糞便標(biāo)本的對比檢測中發(fā)現(xiàn)，該方法與普通RT-PCR相比具有靈敏度高、能夠定量的優(yōu)勢。結(jié)論 本研究建立的檢測GIV諾如病毒的熒光定量一步RT-PCR法，可應(yīng)用于GIV諾如病毒的檢測。

【主題詞】 諾如病毒；GIV；熒光定量

諾如病毒（Norovirus，NoV）是單股正鏈、無包膜的RNA病毒，屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是引起全世界所有人群非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原體之一［1］。根據(jù)諾如病毒衣殼區(qū)的核苷酸序列，將NoV分為5個基因組（genogroup，G），GI-GV，感染人的包括GI、GII和GIV，而GIII和GV分別感染牛和鼠。GIV進(jìn)一步分為兩個基因型，感染人的GIV.1型和感染動物的GIV.2型［2］。GI和GII是諾如病毒引起胃腸炎暴發(fā)最常見的兩個遺傳組［3-4］，而GIV引起暴發(fā)的報道卻是很少見，我國目前未見有關(guān)GIV NoVs報道。本實驗室利用454高通量測序技術(shù)首次在我國河北省盧龍縣發(fā)現(xiàn)人GIV.1 NoV毒株［5］，以此臨床樣本為基礎(chǔ)，建立了靈敏、快速、特異性的GIV諾如病毒熒光定量PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1病毒標(biāo)本與處理 本實驗中GIV NoV陽性毒株（GenBank登錄號為KC894731）是通過454高通量測序發(fā)現(xiàn)，來源于河北省盧龍地區(qū)2011年7月的兒童腹瀉糞便標(biāo)本。采用處理液 PBS對其制成10%便懸液，保存于-20℃。

1.2試劑與儀器 核酸提取試劑盒Vira1 Nuc1eic Acid Extraction Kit II購自Geneaid公司；SuperScript III Reverse Transcriptase購自 Invitrogen公司；2× Power Taq PCR Master Mix kit購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGA script T7 Kit和轉(zhuǎn)錄物純化試劑盒MEGA c1ear Kit購自ABI公司；限制性內(nèi)切酶及相應(yīng)Buffer購自Promega公司；熒光定量RT-PCR試劑盒Quanti Tect Probe RT-PCR Kit購自Qiagen公司。儀器ABI7500熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。

1.3分析軟件 Primer Premier5、DNA MAN6.0、DNAStar software package、Lasergene8、和MEGA 5.0等。

1.4引物和探針 此方法所使用的引物及探針序列，基于ORF1/ORF2重疊區(qū)，此區(qū)域是GIV NoVs株序列中高度保守區(qū)［6］。

1.5核酸提取 采用Vira1 Nuc1eic Acid Extract Kit II從便懸液中提取核酸，方法見說明書。

1.6標(biāo)準(zhǔn)品制備 以本實驗室GIV毒株KC894731序列為基礎(chǔ)，人工合成127 bp的核苷酸序列作為熒光定量一步 RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品（表 1），由北京Tsingke公司完成。此序列與GenBank GIV參考株同源性接近99%。

將合成的核苷酸序列克隆入PGEM-Teasy載體中，位于載體T7啟動子之后。將此重組體轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.co1i DH5a感受態(tài)細(xì)胞擴增，然后用質(zhì)粒提取試劑盒（High-Speed P1asmid Mini Kit）提取質(zhì)粒。用PVUII單酶雙切后，電泳并切割600 bp片段左右的凝膠帶，按照凝膠回收試劑盒（QIAquick Ge1 Extraction Kit）方法操作回收、純化產(chǎn)物，測序以驗證序列正確性。用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（MEGA script T7 Kit）對純化線性質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，然后按照轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化試劑盒（MEGA c1ear Kit）方法進(jìn)行純化。在260 nm處，用分光光度儀對其定量，使用無核酸酶水稀釋至1010拷貝/μ1，以作為熒光定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，保存于-70℃。

1.7熒光定量一步RT-PCR法 使用Qiagen公司的Quanti Tect Probe RT-PCR Kit，一步法RT-PCR反應(yīng)實驗參照試劑盒說書進(jìn)行。反應(yīng)的總體積為25 μ1，體系組分為：2×Quanti Tect Probe RT-PCR Master Mix 12.5 μ1；Quanti Tect RT Mix 0.25 μ1；Mon4F（10 μmo1/L）、Mon4R（10 μmo1/L）各1 μ1；探針Ring4（10 μ1/L）0.5 μ1；RNAse-FREE水7.25 μ1；Temp1ate RNA 2.5 μ1。反應(yīng)條件為：50℃ 30 min；95℃15 min；94℃ 15 s，60℃60 s（共45個循環(huán)）；在60℃收集熒光信號。

1.8熒光定量一步RT-PCR法靈敏度實驗 將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋（108-101拷貝/u1），對它們進(jìn)行熒光定量一步RT-PCR法檢測，以檢測其檢出范圍和最低檢測限。

1.9熒光定量一步RT-PCR法特異性實驗 利用建立起的熒光定量一步RT-PCR法，對GIV、GI和GII NoVs的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，以及輪狀病毒、腸道腺病毒、星狀病毒等腹瀉相關(guān)病毒核酸進(jìn)行檢測，驗證其特異性。

1.10熒光定量一步RT-PCR法重復(fù)性實驗 選取107～105拷貝/μ1范圍的GIV NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量一步RT-PCR法檢測，利用同一批體系對每個稀釋度同時進(jìn)行5次平行檢測，作為批內(nèi)重復(fù)試驗，計算各稀釋度Ct值的平均值和變異系數(shù)，以評價反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。并選取107～105拷貝/μ1范圍的GIV NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)品，在同一周內(nèi)選取3 d各配置體系分別對每個稀釋度進(jìn)行檢測，作為批間重復(fù)試驗，計算每次實驗中Ct值的平均值和變異系數(shù)，以檢驗此種方法的重復(fù)性。

1.11熒光定量一步RT-PCR法對GIV陽性標(biāo)本的檢測 利用建立的熒光定量一步RT-PCR法體系，對實驗室已有兩份GIV陽性糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，并按照La Rosa［7］等報道的方法，進(jìn)行傳統(tǒng)PTPCR方法對現(xiàn)有GIV陽性標(biāo)本的檢驗，以驗證此熒光定量一步RT-PCR法的效果。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 GIV NoV的檢測結(jié)果在108～102拷貝/μ1范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系（圖1A）。以RNA拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到GIV NoV的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Ct=37.29 -3.447×1og（X），r=0.998，擴增效率為95.025%（圖1B）。

A：From 1eft to right is：108-102copies/μ1. B：From 1eft to right is：102-108copies/μ1圖1　GIV型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線Fig.1 PCR amp1ification and standard curve of GIV NoV standard

表1　熒光定量一步RT-PCR法檢測GIV諾如病毒的批內(nèi)和批間重復(fù)性Tab.1 Intra and Inter—assay coefficients of variation of the f1uorescent quantitative one-step RT-PCR to detect GIV NoVs

2.2熒光定量一步RT-PCR法的特異性 除GIV NoV能出現(xiàn)特異性熒光擴增曲線以外，其他病毒和陰性對照均沒有擴增曲線產(chǎn)生。

2.3熒光定量一步RT-PCR法的重復(fù)性 批內(nèi)重復(fù)試驗結(jié)果顯示，GIV NoV每個稀釋度RNA的5個平行反應(yīng)管Ct值的變異系數(shù)均在1.31%以下（表1）。批間重復(fù)試驗結(jié)果顯示，GIV NoV每個稀釋度RNA在三次試驗中Ct值的變異系數(shù)均在3.68%以下（表1）。由此證明此方法對GIV NoV檢測的批內(nèi)和批間重復(fù)性良好。

2.4熒光定量一步RT-PCR法對GIV陽性標(biāo)本的檢測 利用建立的熒光定量一步RT-PCR法體系，對現(xiàn)有的兩份GIV陽性糞便標(biāo)本檢測，結(jié)果與應(yīng)用傳統(tǒng)RT-PCR方法［5］的檢測結(jié)果一致。并且，應(yīng)用傳統(tǒng)PCR的方法，陽性結(jié)果往往是在第二輪PCR后才可以通過凝膠電泳成像出來，所以，相比來說熒光定量一步RT-PCR方法要更為省時、省力，并能夠準(zhǔn)確得到定量結(jié)果。

3 討論

諾如病毒是引起兒童和成人非細(xì)菌性胃腸炎的最主要病原體，諾如病毒主要通過污染的食物和水源傳播，也可通過人-人接觸進(jìn)行傳播，經(jīng)常在醫(yī)院、學(xué)校等場所發(fā)生急性病毒性性胃腸炎暴發(fā)，因此對病毒的快速診斷，對臨床診斷和疾病防控工作具有重要的意義。

全球中有近62%～80%諾如病毒暴發(fā)是由GII.4引起［8-9］，相反，關(guān)于GIV NoVs暴發(fā)報道卻是很少，其通常是在散發(fā)病例和環(huán)境中被檢測出［7，10，11］。至今，GIV NoVs在全球中整體流行情況以及來源還是未知的。不像GI和GII NoVs有成千上萬個有效序列，GIV NoVs在基因庫中卻只有不到70個不完整的序列。目前，已經(jīng)發(fā)表的GIV毒株全基因組序列只有三個，包括在美國涉及暴發(fā)的貓GIV.2 NoV［12］、在澳大利亞［13］和我國發(fā)現(xiàn)人GIV.1 NoVs［5］。其檢測率的低下和基因序列的缺乏，可能反應(yīng)出缺乏特異、靈敏的檢測方法。

目前對GIV NoVs檢測最主要的方法是傳統(tǒng)的RT-PCR方法，但是傳統(tǒng)RT-PCR法易發(fā)生交叉污染，并且需要兩次PCR耗時費力。所以，我們希望能夠建立靈敏、快速、特異的GIV諾如病毒熒光定量PCR檢測方法，應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測，以了解其流行率和病毒載量，希望能夠增加對GIV NoVs的了解，從而對GIV NoVs疾病防控工作具有重要的意義。

本研究所用的引物與探針來自于Truji11o等［6］文章，對GIV NoVs有很好的檢測特異性，與輪狀病毒、GI和GII諾如病毒、腸道腺病毒、星狀病毒等均無交叉反應(yīng)。重復(fù)性試驗表明此檢測體系重復(fù)性良好。其在102拷貝水平能夠穩(wěn)定檢測出GIV NoV，與Truji11o等［6］的文章中所報道檢測限結(jié)果105拷貝水平比較，其靈敏度大大提高，可能與其利用糞便標(biāo)本提取的核酸RNA做標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)，因糞便中的核酸酶和其他RT/PCR抑制劑的存在可以降低其對GIV NoV檢測敏感性。建立的熒光定量一步RTPCR法與傳統(tǒng)PCR方法的檢測結(jié)果比較，證實其能夠檢測出已知的陽性病毒標(biāo)本，并且與之相比更為快速簡便，且能夠精確定量。目前國內(nèi)Yong Yan等［14］報道建立的檢測GIV NoV熒光定量PCR方法，沒有應(yīng)用于陽性標(biāo)本的評價，也還沒有檢出GIV NoV的報道，所以本研究填補了應(yīng)用一步RT-PCR在我國腹瀉病人糞便標(biāo)本對GIV NoV檢測的空白，具有較好實踐意義。但本研究不足之處是，因GIV NoV檢測率依然很低，沒有進(jìn)行大批量的陽性臨床標(biāo)本的評價應(yīng)用。

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Development of fluorescent quantitative one step RT-PCR method for the detection of GIV norovirus

Ao Yuanyun，Yu Jiemei，Zhou Dongmei，Jin Miao，Li Lili，Duan Zhaojun Diarrhea Department，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Centre for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China

Duan Zhaojun，Email：zhaojund@126.com

Objective To estab1ish a f1uorescent quantitative one step rea1 time-PCR method for the detection of GIV NoVs.Methods Specific primers and TaqMan probe of GIV NoVs were ana1ysed and synthesized.Then the reaction system and conditions were optimized and the RNA standard was conducted according to the sequence of human GIV NoVs of our nation.The sensitivity，specificity，and repeatabi1ity of this method were eva1uated，and the traditiona1 RT-PCR method was used to assess the method.Results The sensitivity of this method reached 1.0×102copies/μ1，and the detection range was 102～108copies/μ1. No cross reaction with NoVs（GI，GII），enteric adenovirus，rotavirus，astrovirus and others was found，showing high specificity.By repeated experiments，the intra-assay and inter-assay coefficient of variation （CV）about Ct va1ue was 1ess than 1.31%and 3.68%respective1y，which showed good repeatabi1ity.The method has high sensitivity and accurate quantity advantage by comparison with the traditiona1 RT-PCR on detection of positive samp1es.Conslusions The deve1oped f1uorescent quantitative one step rea1 time PCR method for identification of the GIV NoVs wi11 be app1ied to detecting GIV NoVs in gastroenteritis patients.

norovirus；GIV；f1uorescent quantity

段招軍，Emai1：zhaojund@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.024

2016-01-06）