鄧卓霞 王勇利 杜海軍 司勇鋒 蘭桂萍 孫金杰 楊涌 韓星

530021南寧，廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科（鄧卓霞、王勇利、司勇鋒、蘭桂萍、孫金杰、楊涌、韓星）；100052北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杜海軍、周玲）

廣西地區(qū)三類人群EB病毒潛伏膜蛋白2特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)的研究

鄧卓霞 王勇利 杜海軍 司勇鋒 蘭桂萍 孫金杰 楊涌 韓星

530021南寧，廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科（鄧卓霞、王勇利、司勇鋒、蘭桂萍、孫金杰、楊涌、韓星）；100052北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杜海軍、周玲）

目的 初步探討廣西地區(qū)鼻咽癌患者、血清VCA/IgA陽性高危人群及血清VCA/IgA陰性健康人群EB病毒LMP2特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)的差異。方法 選擇廣西蒼梧地區(qū)經(jīng)血清學(xué)篩查VCA/IgA陽性高危人群志愿者60例，對(duì)照為血清VCA/IgA篩查陰性的健康志愿者20例，同時(shí)選取廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)病理確診鼻咽癌患者134例，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）檢測(cè)外周血中LMP2特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）免疫水平。比較鼻咽癌患者與健康志愿者、高危人群外周血LMP2特異性CTL免疫狀態(tài)的差異。結(jié)果 鼻咽癌患者LMP2特異性CTL免疫水平明顯低于健康志愿者及血清EB病毒抗體陽性人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血清EB病毒抗體陽性三種不同滴度人群間LMP2特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）；鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者同Ⅲ期及Ⅳ期患者的LMP2特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)存在差異（P＜0.01）。結(jié)論 三類人群間LMP2特異性CTL水平的差異可能是導(dǎo)致EB病毒長(zhǎng)期潛伏感染并導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的重要原因，針對(duì)LMP2的特異性免疫治療有望降低鼻咽癌的發(fā)生率。

【主題詞】 鼻咽癌；EB病毒；LMP2；ELISPOT；特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）；免疫治療

Fundprogram：Natura1ScienceFoundationofGuangXiZhuangAutonomousRegion （2011GXNSFA018235）；Science and Techno1ogy P1anning Project of GuangXi Zhuang Autonomous Region （14124003-3，14279008）

鼻咽癌是來源于鼻咽部上皮的一種惡性腫瘤，在我國(guó)東南沿海地區(qū)高發(fā)，廣西蒼梧縣是世界級(jí)鼻咽癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率高達(dá)50/10萬以上［1-3］。在眾多的發(fā)病因素中，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染仍然是鼻咽癌發(fā)病的主要因素之一［4，5］。在鼻咽癌組織中，EBV主要表達(dá)潛伏膜蛋白1（LMP1）、潛伏膜蛋白2（LMP2，包含LMP2A、LMP2B）、EBV核抗原1（EBNA1）等抗原。有研究認(rèn)為L(zhǎng)MP2可以提高上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化能力，并且與鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性［6］，因此針對(duì)LMP2的特異性免疫檢測(cè)可一定程度上反映機(jī)體對(duì)EBV的免疫狀態(tài)。目前已有部分研究在這方面做了有效的嘗試［7，8］，但也存在著入選病例少，缺少不同滴度高危人群間的比較，無病例追蹤隨訪等不足。我們對(duì)廣西地區(qū)健康志愿者（20例）、鼻咽癌高危人群（60例）、鼻咽癌患者（134例）進(jìn)行了EBV-LMP2特異性免疫檢測(cè)，并進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇廣西蒼梧地區(qū)經(jīng)免疫酶法血清學(xué)篩查明確為高危人群（VCA/IgA陽性）的志愿者60例，年齡30～69歲，平均年齡44.5歲，男性23例，女性37例，其中1∶5滴度27例、1∶10滴度22例、1∶20滴度8例、1∶40滴度3例；健康對(duì)照組為該地區(qū)VCA/IgA篩查陰性的志愿者20例，年齡26～61歲，平均年齡47歲，男性9例，女性11例；同時(shí)選擇廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科2011年9月-2013年1月收治的鼻咽癌志愿者134例，年齡20～70歲，平均年齡46.5歲，其中男性89例、女性45例。所有患者均經(jīng)過鼻咽部組織病理確診，并按照 UICC2002分期進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期33例、Ⅲ期47例、Ⅳ期48例。該研究項(xiàng)目獲廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，所有志愿者均簽署知情同意書。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞采集及保存 所有待檢測(cè)人群（鼻咽癌患者在未行治療前）抽取肘靜脈血6～8 m1（BD EDTA抗凝真空采血管），采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（periphera1 b1ood mononuc1ear ce11，PBMC），1×PBS洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞最終濃度為5×106個(gè)/m1，加入含有10%DMSO的凍存液中，放入-80℃低溫冰箱中梯度降溫，過夜后轉(zhuǎn)入液氮保存。

1.3細(xì)胞的復(fù)蘇及活性檢測(cè) ELISPOT檢測(cè)第1天時(shí)將細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍，后用5倍體積的1640培養(yǎng)基洗滌2次，放入含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基10 m1，重懸后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，第2天取20 μ1細(xì)胞懸液加入胎酚蘭染色計(jì)數(shù)，后將細(xì)胞終濃度調(diào)整為2×106個(gè)/m1備用。

1.4EB病毒LMP2特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)

按照ELISPOT試劑盒（551849，BD美國(guó)）說明，第1天將包被抗體儲(chǔ)存液稀釋在無菌1×PBS緩沖液中，每孔加入100 μ1（96孔板），4℃包被過夜。第2天傾倒包被液，加入200 μ1/孔含10%FBS 1640的封閉液，洗板1次，加入200 μ1/孔含10%FBS 1640封閉液，室溫孵育2 h。傾倒封閉液，接種細(xì)胞，加入刺激物，培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的稀釋：先將100 μ1濃度為2×106/m1的細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)孔（100 μ1/孔，復(fù)孔），后分別加入 LMP2特異性多肽（參考LMP2多肽庫(kù)的序列圖，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室合成），設(shè)立陰性對(duì)照孔（加入100 μ1細(xì)胞培養(yǎng)液），陽性對(duì)照孔加入2 μ1植物血凝素（PHA），空白對(duì)照（培養(yǎng)液）；蓋上板蓋，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。第3天，傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，去離子水洗板2次后再用1×PBST（含0.05% Tween-20的1×PBS）洗板3次，加入檢測(cè)抗體100 μ1/孔，加蓋后室溫放置2 h；棄檢測(cè)抗體，每孔用200 μ1 PBST洗滌3次，每孔加入鏈霉親和素標(biāo)記-HRP 100 μ1，室溫孵育1 h；每孔用200 μ1 PBST洗滌4次后再用200 μ1 1×PBS洗滌2次；每孔加入100 μ1的AEC顯色液，室溫靜置5～60 min，隨時(shí)觀察顯色斑點(diǎn)大小，待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后，以去離子水洗滌2次，終止顯色，室溫靜置10～30 min，讓膜自然晾干。將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader 4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)。

1.5ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定 ELISPOT陽性點(diǎn)數(shù)的計(jì)算：試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組都扣除背景（空白對(duì)照）后，ELISPOT陽性點(diǎn)數(shù)=（試驗(yàn)組復(fù)孔的點(diǎn)數(shù)和-陰性對(duì)照組復(fù)孔的點(diǎn)數(shù)和）/2，結(jié)果四舍五入；當(dāng)兩者差值為負(fù)數(shù)時(shí)計(jì)陽性點(diǎn)數(shù)為0。同時(shí)根據(jù)美國(guó)和國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道提出的標(biāo)準(zhǔn)［9］：特異性肽刺激孔形成的斑點(diǎn)數(shù)＞2×無特異性肽刺激的對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)，并且特異性肽刺激孔形成的斑點(diǎn)數(shù)＞10個(gè)斑點(diǎn)，則判為陽性；如陰性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)為0，則特異性肽刺激孔形成的斑點(diǎn)數(shù)＞10個(gè)斑點(diǎn)，即判為陽性。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)試劑采用同一廠家、同一批次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)鼻咽癌患者、高危人群與健康志愿者的LMP2A特異性T細(xì)胞（CTL）免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行Kruska1-Wa11is H檢驗(yàn)，并繪制莖葉圖，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1三類人群LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)比較 鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL水平明顯低于健康志愿者及血清EB病毒抗體陽性人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且三類人群組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1　三類不同人群間EBV-LMP2A特異性CTL水平的比較Fig.1 Comparison of EBV-LMP2A specific CTL 1eve1s among three different groups

2.2健康人群同血清VCA/IgA 1∶5滴度人群間的比較 兩者間的LMP2A特異性CTL免疫反應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.085）。

2.3血清EB病毒抗體陽性三種不同滴度 人群間LMP2A特異性CTL免疫反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），經(jīng)兩兩比較血清滴度12∶0及以上組同1∶5組、1∶10組之間的LMP2A特異性CTL水平存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.002，0.037）；而抗體滴度1∶5組與1∶10組的LMP2A特異性CTL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.057），見圖2。

圖2　不同VCA/IgA滴度人群EBV-LMP2A特異性CTL水平的比較Fig.2 Comparison of EBV-LMP2A specific CTL 1eve1s among different VCA/IgA titer groups

2.4高危人群中血清 VCA/IgA 1∶20及以上滴度人群同早期（Ⅰ、Ⅱ期）鼻咽癌患者間的比較，見兩者間的LMP2A特異性CTL免疫反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），早期鼻咽癌患者的LMP2A特異性CTL免疫狀態(tài)仍低于血清 VCA/IgA 1∶20滴度人群。

2.5鼻咽癌不同臨床分期患者間LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)比較 所有鼻咽癌患者按照臨床分期分為Ⅰ、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期三組，經(jīng)過比較得知三組間的LMP2A特異性CTL免疫反應(yīng)存在差異（P= 0.002）；兩兩比較：Ⅰ、Ⅱ期同Ⅲ期患者間，Ⅰ、Ⅱ期同Ⅳ期患者間，Ⅲ期同Ⅳ期患者間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P=0.042），見圖3。

3 討論

圖3　不同臨床分期鼻咽癌患者間EBV-LMP2A特異性|CTL水平的比較Fig.3 Comparison of EBV-LMP2A specific CTL 1eve1s among different stage in patients of nasopharyngea1 carcinoma

在鼻咽癌患者中，腫瘤細(xì)胞抗原呈潛伏Ⅱ型表達(dá)，即表達(dá)EBNA1、LMP1、LMP2［5］。LMP2A在腫瘤組織中能持續(xù)表達(dá)［10］，且含有多種受HLA限制的細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（CTL）表位，序列較保守。EBV潛伏感染的外周血B細(xì)胞中可檢測(cè)到LMP2A表達(dá)，LMP2A是靜止B細(xì)胞中唯一可檢測(cè)到的EBV潛伏期基因表達(dá)產(chǎn)物，并且是鼻咽癌、淋巴癌等腫瘤細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)的少數(shù)EBV保守抗原之一，具有潛在的T細(xì)胞激活表位，能介導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞發(fā)揮作用。

在人體內(nèi)針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)中，細(xì)胞免疫起主要作用，而T細(xì)胞是細(xì)胞免疫中能夠直接殺傷外來入侵抗原的主要細(xì)胞之一。特異性CTL細(xì)胞能否識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞是能否清除EBV感染并抑制其進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵；而腫瘤患者其自身的EB病毒特異性CTL的免疫作用存在缺陷，必須增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原性，讓EBV特異性CTL可以更好的識(shí)別，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。LMP2A通過HLA-A2限制性CTL來被免疫系統(tǒng)識(shí)別、產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而殺傷靶細(xì)胞，越來越多的研究也表明，LMP2A是治療EBV相關(guān)腫瘤理想的靶抗原［11-13］。

本研究顯示，鼻咽癌患者外周血LMP2A特異性的CTL細(xì)胞數(shù)目明顯少于EB病毒血清學(xué)陽性人群及健康志愿者，且組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示鼻咽癌患者對(duì)LMP2A抗原刺激的免疫反應(yīng)能力明顯低于血清學(xué)陽性人群，同時(shí)EB病毒血清學(xué)陽性人群對(duì)LMP2A抗原刺激的免疫反應(yīng)能力也低于健康人群。Mo等［8］對(duì)不同分期鼻咽癌患者治療前的EBV-LMP2特異性免疫狀態(tài)對(duì)比研究，也得到了相似的結(jié)論。另外，Portis等［14］發(fā)現(xiàn)LMP2A可增強(qiáng)細(xì)胞周期誘導(dǎo)和凋亡抑制等相關(guān)基因的表達(dá)，改變DNA和RNA新陳代謝相關(guān)基因表達(dá)，減少B細(xì)胞特異性因子和免疫相關(guān)基因的表達(dá)。由于LMP2A 對(duì)EBV的潛伏感染起到重要的作用，可能是EBV相關(guān)的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一：機(jī)體對(duì)LMP2A的免疫識(shí)別和清除能力下降，使表達(dá)LMP2A 的B淋巴細(xì)胞增殖，LMP2A又可以抑制免疫相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步降低機(jī)體對(duì)LMP2A的免疫能力，這一循環(huán)可能導(dǎo)致EBV在局部長(zhǎng)期感染并不斷增殖，刺激鼻咽上皮增生，最終導(dǎo)致腫瘤的最終發(fā)生。另外，不同人群間的EBV-LMP2特異性免疫差異也是LMP2A免疫治療的基礎(chǔ)，通過早期對(duì)有高危人群的免疫干預(yù)有可能會(huì)阻止疾病的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌高危人群中，不同滴度人群對(duì)LMP2A抗原刺激的免疫反應(yīng)能力也存在差異，高滴度人群的LMP2A特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)要低于低滴度人群。由于血清學(xué)滴度可以間接反映出EB病毒潛伏感染的狀態(tài)，因此兩者檢測(cè)存在著一致性。在鼻咽癌患者中早期患者的LMP2A特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)要好于晚期患者，其可能原因是早期患者的腫瘤較局限，循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞較少，機(jī)體也可存在一定程度特異性細(xì)胞免疫。本研究中健康人群同血清VCA/IgA 1∶5滴度人群之間、1∶5滴度人群同1∶10滴度人群之間的LMP2A特異性免疫狀態(tài)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能受入組人數(shù)的影響所致，具體差異情況可能需要更大樣本量的研究驗(yàn)證。

近年來，EBV-LMP2特異性CTL在臨床中的應(yīng)用也引起人們的關(guān)注。中國(guó)臺(tái)灣學(xué)者林成龍等［15］用DC負(fù)載LMP2多肽對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)16例鼻咽癌治療后復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人中，有9例患者的特異性免疫被誘導(dǎo)出或者被增強(qiáng)，并且這種特異性免疫持續(xù)3個(gè)月之久，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其中2例患者的局部腫瘤部分消退。中國(guó)香港Hui等［16］及英國(guó) Tay1or等［17］進(jìn)行的以 LMP2A及EBNA1多肽為免疫原的MVA-EL疫苗I期臨床試驗(yàn)，也取得了較好的免疫效果，安全性也得到了肯定。國(guó)內(nèi)目前本單位在曾毅院士的帶領(lǐng)下已經(jīng)完成將LMP2A作為疫苗免疫EBV陽性的鼻咽癌患者，Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果提示安全且能有效提高特異性免疫反應(yīng)，下一步計(jì)劃在高危人群中進(jìn)行相應(yīng)的免疫研究。

盡管EBV相關(guān)腫瘤病因?qū)W中EBV的確切作用并不十分清楚，但腫瘤細(xì)胞中EB病毒的存在、鼻咽癌患者對(duì)于LMP2A特異性的T細(xì)胞免疫下降可能是導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的重要原因之一，通過提高機(jī)體對(duì)LMP2A的識(shí)別及免疫反應(yīng)，可能是對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行免疫治療的有效途徑之一。

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Analysis of EB virus LMP2 specific immune status among three groups in Guangxi area

DengZhuoxia，Wang Yongli，Du Haijun，Si Yongfeng，Lan Guiping，Sun Jinjie，Yang Yong，Han Xing Department of Otolaryngology Head and Neck Tumor，People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，China（Deng ZX，Wang YL，Si YF，Lan GP，Sun JJ，Yang Y，Han X）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infections Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China（Du HJ，Zhou L）

Si Yongfeng，Email：syfklxf@126.com

Objective To investigate the difference of EB-LMP2 specific immune status among patients with nasopharyngea1 carcinoma，serum EBV VCA/IgA positive group and EBV VCA/IgA negative group in Guangxi area of china.Methods 60 cases of serum EBV VCA/IgA screening positive vo1unteers and 20 cases of negative vo1unteers came from Cangwu county in Guangxi area，and 134 cases of patients vo1unteers with nasopharyngea1 carcinoma（NPC）came from The Peop1e′s Hospita1 of Guangxi Zhuang Autonomous Region.B1ood samp1es were taken before any treatment，and the preiphera1 b1ood mononuc1ear ce1s（PBMC）were taken by Fico11 density gradient centrifugation.Specific immune responses of cytotoxic T 1ymphocytes（CTLs）were measured using IFN-γ ELISPOT assays with HLA-matched LMP2 epitope peptides.Results LMP2 specific immune responses 1eve1s in nasopharyngea1 carcinoma patients were significant1y 1ower than those hea1thy vo1unteers and serum EBV VCA/IgA screening positive vo1unteers（P ＜0.01），and the immune responses were statistica11y different in three VCA/IgA titers（1∶5，1∶10 and 1∶20 or more，P=0.002）；LMP2 specific immune responses in ear1y stage patients of nasopharyngea1 carcinoma （stage I/II）were better than those advanced stage（stageⅢ and stage IV）（P＜0.01）.Conclusions The difference of LMP2 specific CTL 1eve1s among three groups may be the important reason for the 1ong-term1atent infection of EB virus and 1ead to the occurrence of nasopharyngea1 carcinoma，and LMP2 specific immunotherapy is expected to reduce the incidence of nasopharyngea1 carcinoma.

Nasopharyngea1 carcinoma（NPC）；EB virus；LMP2；ELISPOT；cytotoxic 1ymphocyte，CTL，immunotherapy

廣西自然科學(xué)基金（2011GXNSFA018235）；廣西科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（14124003-3、14279008）

司勇鋒，Emai1：syfk1xf@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.021

2015-12-07）